
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶,分子量为94 KD。扩增片段的长度可达10 kb(简单模板)。延伸速度为1min/kb(70~75℃,简单模板可达10s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性,无3'→5'外切酶活性。扩增产物具有3'-dA,可直接用于TA克隆。
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Taq DNA聚合酶是嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶,分子量为94 KD。扩增片段的长度可达10 kb(简单模板)。延伸速度为1min/kb(70~75℃,简单模板可达10s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性,无3'→5'外切酶活性。扩增产物具有3'-dA,可直接用于TA克隆。
产品组成
Component |
P1011 500U |
P1012 500U |
P1013 1,000U |
P1014 1,000U |
P1015 12,000U |
Taq DNA聚合酶(5U/μl)[1] |
100 μl |
100 μl |
200 μl |
200 μl |
100 μl × 24 |
Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)[1] |
200 μl |
200 μl |
400 μl |
400 μl |
200 μl × 24 |
10× Taq Buffer(Mg2+ Plus)[2] |
1.25 ml |
1.25 ml |
1.25 ml × 2 |
1.25 ml × 2 |
1.25 ml × 24 |
10× Tpol Buffer(Mg2+ Plus)[2] |
1.25 ml |
1.25 ml |
1.25 ml × 2 |
1.25 ml × 2 |
1.25 ml × 24 |
6× Loading Buffer |
1 ml1 ml |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
- |
dNTPs(2.5mM) |
- |
1 ml |
- |
1 ml × 2 |
- |
[1] 提供5U/μl和2.5U/μl两种活性单位的包装可供选择,如无特别说明默认5U/μl。
[2] 10× Taq Buffer和10× Tpol Buffer 分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装可供选择,如无特别说明默认Mg2+ Plus。Mg2+ Free的10× Taq Buffer提供25mM MgCl2,Mg2+ Free的10× Tpol Buffer提供25mM MgSO4。Taq Buffer能满足大多数常规PCR反应,优先使用此Buffer。Tpol Buffer对于提高PCR特异性有显著作用。
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存条件
-20℃保存2年。
质量控制
纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。
应用举例
1. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:
Ordinal |
Component |
Volume (50 μl reaction volume) |
Final concentration (50 μl reaction volume) |
1 | 10× Taq Buffer(Mg2+Plus)[1] |
5 μl |
1× |
2 | dNTPs(2.5mM) |
4 μl |
0.4 mM |
3 | upstream primer (10 μM)[2] |
2 μl |
0.4 μM |
4 | downstream primer (10 μM)[2] |
2 μl |
0.4 μM |
5 | Taq DNA聚合酶(5U/μl)[3] |
0.5 μl |
2.5U |
6 | template DNA[4] |
1-4 μl |
<1μg |
7 | 超纯水 |
To 50 μl |
- |
optional |
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer |
Variable |
- |
[1] Taq Buffer能满足大多数常规PCR反应,优先使用此Buffer。若要提高特异性可使用Tpol Buffer。
[2] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。
[3] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。
[4] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。
Template
Dosage
人类基因组DNA
0.1μg-1μg
λDNA
0.1μg-1μg
大肠杆菌基因组DNA
10ng-100ng
质粒DNA
0.1ng-10ng
2. 设定反应程序进行PCR反应
Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
Denaturation |
94℃ |
30 sec |
25-35 |
Annealing |
55-68℃[1] |
30 sec |
|
Extension |
72℃ |
Variable[2] |
|
Final Extension |
72℃ |
5-10 min |
1 |
[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。
[2] 延伸时间按1min/kb来设最佳(简单模板可达10s/kb)。
3. 分析结果
将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。
无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量操作注意事项
1 室温下Taq DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Taq DNA聚合酶或模板DNA。
2 Taq DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性,因此在PCR产物3'末端通常会加上1个多余的脱氧腺嘌呤核苷,可直接用于TA克隆。也可以使用Taq DNA聚合酶进行加A反应。
3 碱基错误率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Taq DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-5。
引物设计注意事项
引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。
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