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0
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶

供应商货号:P1011,P1012,P1013,P1014,P1015

详情

Taq DNA聚合酶是嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶,分子量为94 KD。扩增片段的长度可达10 kb(简单模板)。延伸速度为1min/kb(70~75℃,简单模板可达10s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性,无3'→5'外切酶活性。扩增产物具有3'-dA,可直接用于TA克隆。

产品组成

Component

P1011

500U

P1012

500U

P1013

1,000U

P1014

1,000U

P1015

12,000U
Taq DNA聚合酶(5U/μl)[1]
100 μl
100 μl
200 μl
200 μl
100 μl × 24
Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)[1]
200 μl
200 μl
400 μl
400 μl
200 μl × 24
10× Taq Buffer(Mg2+ Plus)[2]
1.25 ml
1.25 ml
1.25 ml × 2
1.25 ml × 2
1.25 ml × 24
10× Tpol Buffer(Mg2+ Plus)[2]
1.25 ml
1.25 ml
1.25 ml × 2
1.25 ml × 2
1.25 ml × 24
6× Loading Buffer
1 ml1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
-
dNTPs(2.5mM)
-
1 ml
-
1 ml × 2
-

[1] 提供5U/μl和2.5U/μl两种活性单位的包装可供选择,如无特别说明默认5U/μl。

[2] 10× Taq Buffer和10× Tpol Buffer 分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装可供选择,如无特别说明默认Mg2+ Plus。Mg2+ Free的10× Taq Buffer提供25mM MgCl2,Mg2+ Free的10× Tpol Buffer提供25mM MgSO4。Taq Buffer能满足大多数常规PCR反应,优先使用此Buffer。Tpol Buffer对于提高PCR特异性有显著作用。

活性定义

一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:

Ordinal
Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)
1 10× Taq Buffer(Mg2+Plus)[1]
5 μl

2 dNTPs(2.5mM)
4 μl
0.4 mM
3 upstream primer (10 μM)[2]
2 μl
0.4 μM
4 downstream primer (10 μM)[2]
2 μl
0.4 μM
5 Taq DNA聚合酶(5U/μl)[3]
0.5 μl
2.5U
6 template DNA[4]
1-4 μl
<1μg
7 超纯水
To 50 μl
-
optional
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer
Variable
-

[1] Taq Buffer能满足大多数常规PCR反应,优先使用此Buffer。若要提高特异性可使用Tpol Buffer。

[2] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[3] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。

[4] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。

Template
Dosage
人类基因组DNA
0.1μg-1μg
λDNA
0.1μg-1μg
大肠杆菌基因组DNA
10ng-100ng
质粒DNA
0.1ng-10ng

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage
Temperature
Time
Number of Cycles
Initial Denaturation
94℃
3 min
1
Denaturation
94℃
30 sec
25-35
Annealing
55-68℃[1]
30 sec
Extension
72℃
Variable[2]
Final Extension
72℃
5-10 min
1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按1min/kb来设最佳(简单模板可达10s/kb)。

3. 分析结果

将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量

操作注意事项

1 室温下Taq DNA聚合酶有一定的活性,为避免发生非特异性扩增,请于冰上配置反应体系,并且最后添加Taq DNA聚合酶或模板DNA。

2 Taq DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性,因此在PCR产物3'末端通常会加上1个多余的脱氧腺嘌呤核苷,可直接用于TA克隆。也可以使用Taq DNA聚合酶进行加A反应。

3 碱基错误率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Taq DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-5。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

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