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Hotstart Mix

供应商货号:P2041,P2042

详情

Hotstart Mix是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液,含有Hotstart Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR,大大简化操作过程,缩短操作时间,降低污染(加样次数减少)同时,由于体系内含有增强剂,能够显著增强PCR扩增的灵敏度。扩增产物具有3’-dA突出端,可直接用于TA克隆。

Hotstart Taq DNA聚合酶是一种创新型的化学修饰热启动酶,该酶在室温下活性被完全封闭,依赖温度激活酶活性,可有效减少非特异性扩增,具有非常高的特异性。扩增片段长度可达5 kb(简单模板)。延伸速率为2min/kb(70-75℃,简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性,无3'→5'外切酶活性。扩增产物具有3'-dA末端。Hotstart Taq DNA聚合酶采用先进的化学修饰技术生产,动物源性DNA污染为零,稳定性更强,具有抗体法热启动酶不可比拟的优势。同时,预变性时间缩短至3分钟,工作效率比大多数化学修饰法热启动酶更高,是一款非常新颖、实用的产品。

产品组成

Component
P2041
P2042
2× Hotstart Mix
1 ml
1 ml   × 5
超纯水
1 ml
1 ml   × 5

本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品,PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如无特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。

应用举例

1. 配制反应体系

请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:
Ordinal
Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)
1 2× Hotstart Mix
25 μl

2 upstream primer (10 μM)[1]
2 μl
0.4 μM
3 downstream primer (10 μM)[1]
2 μl
0.4 μM
4 template DNA[2]
1-4 μl
<1μg
5 超纯水
To   50 μl
-
optional
MgCl2(MgSO4)/PCR   Enhancer[3]
Variable
-

[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。

[2] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)

Template
人类基因组DNA
λDNA
大肠杆菌基因组DNA
质粒DNA
Dosage
0.1μg-1μg
0.5ng-5ng
10ng-100ng
0.1ng-10ng

[4] 可单独订购25mM MgCl2和PCR Enhancer。

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage  
Temperature
Time
Number   of Cycles
Initial   Denaturation
94℃
3 min
1
Denaturation
94℃
30 sec
25-35  
Annealing
55-68℃[1]
30 sec
Extension
72℃
Variable[2]
Final   Extension
72℃
5-10   min
1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。

[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。

3. 分析结果

反应产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量。

操作注意事项

1 本产品采用改进的化学修饰技术,依赖温度激活DNA聚合酶,能有效抑制非特异性结合,可在室温下配置反应体系。

2 Hotstart Taq DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性,因此在PCR产物3'末端通常会加上1个多余的脱氧腺嘌呤核苷,可直接用于TA克隆。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。

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