血浆中尼古丁及代谢产物可替宁的检测
- 2022-07-12 16:35:43
- 逗点生物
一、引言
长期吸食烟草，会增加患许多疾病的风险，包括肺癌、慢性阻塞性肺病、中风、心脏病和呼吸系统感染等。目前吸烟与健康 已成为世界最受关注的公共卫生问题之一，科学准确测量烟草暴露是研究烟草暴露与健康相关性的基础。尼古丁及其代谢物 可替宁是评价烟草暴露的关键生物标记物，通过对尿液、血液、唾液和头发等生物材料中的尼古丁和可替宁的测定，能够评 估人体吸烟行为、戒烟情况以及环境烟气的暴露程度和剂量。
尼古丁（NT） 可替宁（CN）
本研究以血浆为样本，经净化处理，采用同位素内标，建立了一套血浆中尼古丁及其代谢物可替宁 LC-MS/MS 的准确定性定量分析方法。经过方法学验证及实际样品的测定考察，本法具有高的灵敏度、稳定性及准确性，可适用于血浆样品中 NT、CN 的检测分析。
二、结果讨论
2.1 定量限
血浆样品中 NT、CN 定量限及其内标物代表图谱见图 1。
2.2 标准曲线和线性
对不同日期处理的多批次样品的线性进行考察，发现批次间的线性良好，R 值均大于 0.997，可确保检测结果的准确性。
表 1 NT、CN 标准曲线和线性
日期 |
线性方程 |
回归系数R |
||||
线性范围（NT）（µg/L） |
线性回归方程（NT） |
线性范围（CN）（µg/L） |
线性回归方程（CN） |
NT |
CN |
|
Day1 |
0.500~200 |
Y=1.20046+0.246644X |
0.500~200 |
Y=0.0709538+0.166333X |
0.9986 |
0.9995 |
Day2 |
0.500~200 |
Y=1.84801+0.237277X |
0.500~200 |
Y=0.195728+0.160106X |
0.9976 |
0.9988 |
Day3 |
0.500~200 |
Y=1.26099+0.253901X |
0.500~200 |
Y=0.0454831+0.169832X |
0.9995 |
0.9999 |
Day4 |
0.500~200 |
Y=1.51751+0.265835X |
0.500~200 |
Y=0.0125689+0.181065X |
0.9988 |
0.9999 |
Day5 |
0.500~200 |
Y=1.14842+0.264235X |
0.500~200 |
Y=0.05221410+0.181829X |
0.9993 |
0.9998 |
2.3 稳定性实验
2.3.1 日内稳定性
一天内重复进行 3 次试验，每次试验进行 6 个空白样品的加标测定，获得日内稳定性。结果显示 NT 日内 RSD ＜ 6%，CN 日内RSD ＜ 2%，说明方法稳定可靠，重现性好。
表 2 NT、CN 日内稳定性
样本名称 |
Nicotine |
Cotinine |
1#1 |
21.194 |
20.324 |
1#2 |
17.880 |
19.729 |
1#3 |
19.991 |
20.842 |
1#4 |
19.814 |
20.119 |
1#5 |
20.202 |
19.920 |
1#6 |
19.301 |
19.991 |
2#1 |
19.029 |
20.355 |
2#2 |
19.841 |
19.953 |
2#3 |
20.458 |
20.351 |
2#4 |
19.228 |
20.293 |
2#5 |
20.170 |
20.463 |
2#6 |
19.201 |
20.215 |
3#1 |
20.155 |
20.661 |
3#2 |
18.729 |
19.950 |
3#3 |
21.982 |
19.948 |
3#4 |
18.198 |
19.678 |
3#5 |
19.564 |
19.761 |
3#6 |
19.308 |
19.861 |
Average |
19.680 |
20.134 |
RSD |
5.02% |
1.62% |
2.3.2 日间稳定性
5 天内，每天进行 6 个空白样品的加标测定，以获得日间稳定性。结果显示 NT 日间 RSD ＜ 6%，CN 日间 RSD ＜ 5%，说明方法稳定可靠，重现性好。
表 3 NT、CN 日间稳定性
样本名称 |
Nicotine |
Cotinine |
Day1-1 |
18.485 |
19.832 |
Day1-2 |
18.283 |
18.889 |
Day1-3 |
17.765 |
18.895 |
Day1-4 |
19.151 |
19.316 |
Day1-5 |
18.077 |
19.183 |
Day1-6 |
19.198 |
19.636 |
Day2-1 |
18.753 |
18.701 |
Day2-2 |
18.154 |
19.642 |
Day2-3 |
19.871 |
19.78 |
Day2-4 |
18.611 |
19.799 |
Day2-5 |
20.791 |
20.06 |
Day2-6 |
19.784 |
19.821 |
Day3-1 |
18.504 |
19.435 |
Day3-2 |
19.061 |
18.647 |
Day3-3 |
18.561 |
19.075 |
Day3-4 |
18.688 |
18.705 |
Day3-5 |
18.297 |
18.579 |
Day3-6 |
17.726 |
19.015 |
Day4-1 |
16.888 |
18.163 |
Day4-2 |
18.344 |
18.499 |
Day4-3 |
18.35 |
18.412 |
Day4-4 |
19.954 |
17.389 |
Day4-5 |
20.545 |
17.717 |
Day4-6 |
20.883 |
17.869 |
Day5-1 |
19.029 |
20.355 |
Day5-2 |
19.841 |
19.953 |
Day5-3 |
20.458 |
20.351 |
Day5-4 |
19.228 |
20.293 |
Day5-5 |
20.170 |
20.463 |
Day5-6 |
19.201 |
20.215 |
Average |
19.022 |
19.223 |
RSD |
5.15% |
4.38% |
2.4 加标回收率
样品低、中、高浓度加标结果如下图。通过验证可知，三个浓度的加标回收率均大于 81%，且回收率平行测定 RSD 较小，说明方法测定结果准确及重现性好，可以确保样品测定的准确性。
表 4 NT、CN 加标回收率结果
样本编号 |
|
Nicotine |
|
|
|
|
Cotinine |
|
|
|
加标浓度（ng/mL） |
基质本底（ng/mL） |
回收率 |
平均值 |
RSD |
加标浓度（ng/mL） |
基质本底（ng/mL） |
回收率 |
平均值 |
RSD |
|
S1-1 |
5 |
0.695 |
81.43% |
88.36% |
7.50% |
5 |
0.104 |
86.98% |
89.69% |
2.67% |
S1-2 |
94.64% |
90.60% |
||||||||
S1-3 |
89.02% |
91.50% |
||||||||
S1-1 |
20 |
0.695 |
104.25% |
98.99% |
4.95% |
20 |
0.104 |
96.89% |
95.42% |
1.23% |
S1-2 |
94.55% |
94.53% |
||||||||
S1-3 |
98.16% |
94.84% |
||||||||
S3-1 |
100 |
0.695 |
97.88% |
94.29% |
2.28% |
100 |
0.104 |
96.65% |
93.54% |
2.26% |
S3-2 |
93.54% |
91.89% |
||||||||
S3-3 |
93.22% |
93.53% |
||||||||
S3-5 |
94.50% |
94.31% |
2.5 实际样品测定
对大量实际样品的测定验证方法的可靠性，从图 2 可以看出，实际样品测定可以获得理想的检测结果，且不存在基质干扰和其他异常干扰峰，说明方法专属性高、特异性强，适合样品的检测。
三、总结
图 2 实际样本测定色谱图
本文建立了一套血浆中 NT、CN 的 LC-MS/MS 方法，通过对定量限、线性、日内 / 日间稳定性、回收率等方法学的验证，本方法灵敏度高、准确可靠、重现性好，完全满足日常样品的测定要求。通过实际样品的测定，也说明了本方法可靠性，可用 于血浆样品中 NT、CN 的测定。
