人体尿液中儿茶酚胺及其代谢物的检测

2022-07-12 16:35:43
逗点生物
简介

一、引言

儿茶酚胺(CAs)是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质。儿茶酚和胺基通过L- 络氨酸在交感神经、肾上腺髓质和亲铬细胞位置的酶化步骤结合。通常,儿茶酚胺是指多巴胺

(DA)、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E),而去甲变肾上腺素(NMN,又名甲氧基去甲肾上腺素)、变肾上腺素

(MN,又名甲氧基肾上腺素)和3- 甲氧基酪胺(3-MT)分别是NE、E 和DA 的代谢产物。

 

尿液中CAs 及其代谢物水平与人体多种生理、病理现象有密切关系,临床研究发现CAs 可以用于临床辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病, 其代谢物MN 以及NMN 对诊断嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤有极高的敏感度与准确度,是内分泌指南推荐的首选检测指 标。


本方案建立了尿液中CAs 及其代谢物测定方法,并对其进行了方法学验证。经验证方法定量限为5 ng/mL,低中高三水平加标回收率介于90%-110% 之间,低中高质控 CV 值小于8%。

 

图1 儿茶酚胺及其代谢物分子结构

表1 各组分质谱采集离子参数

Compound

Precursor (m/z)

Product (m/z)

Collision Energy (V)

RF Lens (V)

 

 

NE

 

 

152.088

77.179

28.35

 

 

107

107.125

15.8

135

11.29

 

 

DA

 

 

154.088

91.155

21.26

 

 

70

119.083

16.75

137

10.23

 

 

 NE-D6

 

 

158.125

111.1

17.01

 

 

112

112.1

17.2

140.071

13.49

 

 

 DA-D4

 

 

158.138

95.137

22.97

 

 

71

122.113

16.82

141.071

11.59

 

NMN

 

166.088

121.054

15.35

 

106

134.071

15.31

 

 

 3-MT

 

 

168.088

91.155

22.02

 

 

68

119.083

16.82

151

10.23

 

 

 NMN-D3

 

 

169.1

109.095

18.53

 

 

108

123.083

15.91

137.071

15.42

 

 

 3-MT-D4

 

 

172.125

95.137

23.19

 

 

71

123.042

17.66

155.083

11.06

 

 

MN

 

 

180.088

120.113

16.9

 

 

 

 

 

129

121.054

17.05

148.012

16.75

165

15.04

 

 

 MN-D3

 

 

183.088

123.083

17.66

151.054

16.86

168

15.31

 

 

E

 

 

184.088

107.1

19.14

 

 

68

151

18.53

166

10.23

 E-D3

187.088

169.012

11.1

70

二、实验结果

2.1 色谱图

儿茶酚胺及其代谢物以及其同位素内标提取离子色谱图分别见图二



2.1 校正曲线

E、NE、DA、MN、NMN、3-MT 基质校正曲线见图3,线性范围2-200 ng/mL,线性相关性R2 >0.998。



2.1 回收率及稳定性

表2 尿液中儿茶酚胺及其代谢物加标回收率结果

图3 E、NE、DA、MN、NMN、3-MT 校正曲线


 

 

加标浓度(ng/mL)

回收率(%,n=4)

E

NE

DA

MN

NMN

3-MT

10

93.62%

107.53%

109.06%

103.48%

102.92%

92.54%

50

90.45%

95.81%

90.65%

93.12%

95.14%

90.19%

200

104.97%

97.08%

98.46%

101.77%

103.13%

102.47%

从表2 可以看出,不用加标浓度下,6 种化合物都有较好的回收率。

 

表3 尿液中儿茶酚胺及其代谢物日间稳定性结果

 

水平

CV(%,n=20)

E

NE

DA

MN

NMN

3-MT

3.21%

6.87%

7.67%

6.70%

6.21%

5.26%

3.61%

5.24%

3.02%

2.23%

3.43%

2.87%

4.68%

6.17%

5.13%

4.12%

6.51%

5.01%

该部分实验从不同批次萃取板中抽取不同孔位进行测试。从目标化合物的结果可以看出,该产品稳定性良好。

 

三、总结

本方法通过HPLC-MS/MS 对尿液中儿茶酚胺及其代谢物进行联合测定,对方法回收率、定量限进行实验,并为考察方法稳定性进行了批间、日内、日间稳定性等方面的验证,方法稳定可靠,灵敏度高,特异性强,满足检测要求。