皱纹纸微生物检验方法：菌落总数、大肠菌群与致病菌筛查要点

皱纹纸是一类具有皱缩纹理、柔软性和吸液性的纸制品，可用于包装、擦拭、卫生相关材料或其他轻工产品。若产品用于接触人体、食品、医疗包装或卫生用品相关场景，微生物污染水平就不只是外观质量问题，还关系到使用安全。旧版轻工行业标准中对皱纹纸的微生物检查，主要包括细菌菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌等项目。

原文为轻工行业标准节选，具有方法学参考价值。需要注意的是，该类旧标准方法与现行食品、化妆品、消毒产品、一次性卫生用品或医疗包装材料的检验方法并不完全等同。若用于正式出厂检验、注册检验或第三方报告，应以当前有效标准、产品执行标准和客户要求为准。本文按原文逻辑进行整理，并对部分表述作必要修正，使其更适合知识库发布。

一、样品采集：代表性和无菌操作是前提

标准节选要求从同一批号的三个大包装中，至少随机抽取 15 包小包装样品，其中三分之一用于检测，三分之一留样，三分之一用于必要时复测。这样的分配思路是合理的：检测样品用于当次检验，留样用于结果追溯，复测样品用于异常结果确认。

样品最小包装不得破损，检验前不得开启。原因很直接：一旦包装破裂或提前打开，样品可能受到环境、人员或工具污染，检测结果就不能真实反映产品原始微生物状态。对纸类样品而言，粉尘、纤维碎屑和包装破损都可能影响菌落计数结果，因此采样时应记录包装完整性、批号、采样位置和样品状态。

二、样品处理：10 g 样品加入 100 mL 生理盐水

原文要求在 100 级净化条件下或超净工作台中无菌打开至少 5 个小包装，从中随机称取 10 g 样品，剪碎后加入 100 mL 灭菌生理盐水中，振打 80 次或用混匀器充分混匀。这里的“100 级净化条件”属于旧式洁净度表述，现代文件中常对应更规范的洁净等级表达；实际操作中可理解为在能有效减少外源污染的洁净环境中进行。

10 g 样品加入 100 mL 生理盐水后，若微生物充分洗脱到液体中，则每 1 mL 样液约代表 0.1 g 样品。因此后续平板计数时，若每皿接种 1 mL，结果换算为 CFU/g 时需乘以 10。原文中的计算公式“平板平均菌落数 × 10”就是基于这一换算逻辑。

纸类样品与食品匀浆不同，纤维不溶且易漂浮或沉降，所以原文要求待样液自然沉降后取上清液检测。这样可减少纤维碎屑对倾注平板、菌落观察和计数的干扰。但沉降时间应尽量统一，否则不同操作者之间可能产生偏差。

三、细菌菌落总数：反映一般细菌污染水平

细菌菌落总数检测采用倾注平板法。取样液上清液，每皿加入 1 mL，共接种 6 个平皿，再加入约 45℃冷却后的熔化营养琼脂 15 mL，混匀凝固后倒置，于 37℃培养 24 h，计算平板菌落数。当平板菌落数超过 300 时，应对样液进行适当稀释后重新计数。

这里需要补充一点：该方法测得的是在规定培养基、温度和时间下能够形成菌落的需氧或兼性厌氧细菌数量，并不等于样品中所有微生物总量。霉菌、酵母菌、严格厌氧菌、低温菌或生长缓慢菌可能不会被充分反映。

计算公式为：

细菌菌落总数（CFU/g）= 平板菌落平均数 × 10 × 稀释倍数

若未进行额外稀释，则稀释倍数按 1 计。菌落呈片状生长、蔓延生长或融合严重的平板不宜用于计数。菌落数在 100 以内时可按实有数报告；大于 100 时通常采用两位有效数字报告。原文提出“结果超过标准值 10% 必须重复检测一次”，可理解为旧标准中的复核规则，实际执行时应以企业质量文件和现行标准规定为准。

四、大肠菌群：提示粪源或卫生污染风险

大肠菌群检测采用乳糖胆盐发酵管初筛，再用伊红美蓝琼脂平板分离确认。取样液上清液接种乳糖胆盐发酵管，共 3 管，每管 1 mL，37℃培养 24 h。若不产酸、不产气，可报告大肠菌群阴性；若产酸产气，则进一步划线接种伊红美蓝琼脂平板。

在伊红美蓝琼脂上，典型大肠菌群菌落可呈黑紫色、紫红色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，部分具有金属光泽。挑取可疑菌落 1～2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管观察产气。若乳糖胆盐管产酸产气、乳糖发酵管产气、伊红美蓝平板有典型菌落，且镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，可报告检出大肠菌群。

需要强调：大肠菌群阳性并不等同于检出大肠埃希氏菌，也不等同于检出致病菌。它更多反映产品可能存在原料、生产环境、人员操作或包装过程的卫生控制问题。

五、金黄色葡萄球菌：人员污染和皮肤来源污染的重点指标

金黄色葡萄球菌常与人体皮肤、鼻腔、咽喉、伤口和操作污染有关。皱纹纸若用于卫生相关场景，检出金黄色葡萄球菌提示生产、分装或包装环节可能存在人员卫生或环境污染问题。

原文方法为：取样液 5 mL 加入 50 mL SCDLP 培养液中，37℃培养 24 h。SCDLP 培养液通常含大豆酪蛋白消化物、卵磷脂和聚山梨酯等成分，适合对可能含抑菌残留或表面活性物质的样品进行增菌和中和。增菌后取 1～2 接种环划线接种血琼脂平板，37℃培养 24～48 h，观察可疑菌落。

典型金黄色葡萄球菌在血琼脂上可形成圆形、凸起、不透明、表面光滑的菌落，部分呈金黄色，并可出现溶血圈。但金黄色、溶血和菌落大小均不是绝对特征，部分菌株色素弱或不明显，部分葡萄球菌也可能形成相似菌落，因此必须进一步确认。

确认项目包括革兰氏染色、甘露醇发酵和血浆凝固酶试验。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，常呈葡萄串状排列，不形成芽胞。原文写“无荚膜”不宜作为绝对特征，更适合表述为通常不形成明显荚膜。血浆凝固酶阳性是传统鉴定金黄色葡萄球菌的重要依据，玻片法可作快速筛查，试管法更适合确认可疑结果。

若平板上有可疑菌落，镜检符合革兰氏阳性葡萄球菌特征，甘露醇发酵产酸，血浆凝固酶试验阳性，可报告检出金黄色葡萄球菌。

六、溶血性链球菌：应结合溶血、形态和确认试验判断

溶血性链球菌检测通常用于评价产品中是否存在化脓性链球菌样污染风险。原文方法为：取样液 5 mL 加入 50 mL 匹克氏肉汤，37℃培养 24 h；再划线接种血琼脂平板，37℃培养 24 h，观察菌落和溶血情况。

血琼脂上典型溶血性链球菌菌落可为灰白色、针尖状、半透明或不透明，表面光滑，边缘整齐，周围出现透明溶血圈。挑取典型菌落进行革兰氏染色，应见革兰氏阳性球菌，呈链状排列。实际鉴别中，还可增加触酶试验：链球菌通常触酶阴性，可与葡萄球菌作基础区分。

原文采用链激酶试验和杆菌肽敏感试验进行确认。杆菌肽敏感试验在传统方法中常用于 A 群 β-溶血性链球菌筛查，但不是所有溶血性链球菌的通用确认标准。现代实验室若需要更准确鉴定，可结合 Lancefield 分群、乳胶凝集、MALDI-TOF MS 或分子方法。作为旧标准方法解读，可保留其判定逻辑，但应说明其属于传统确认组合。

若镜检为革兰氏阳性链状排列球菌，血平板出现透明溶血圈，链激酶和杆菌肽试验阳性，可按原标准逻辑报告检出溶血性链球菌。

七、四项微生物指标的意义

这些项目并不是对所有病原微生物的全面筛查，而是针对纸类卫生质量的基础微生物控制指标。结果合格说明样品在这些指标下符合要求，但不代表完全无菌，也不代表不存在其他微生物。

八、操作注意事项

第一，样品开启和剪碎必须在洁净条件下进行，剪刀、镊子、称量器具和容器均应无菌。

第二，样品必须来自完整最小包装。破损包装样品不适合作为常规判定依据。

第三，样液混匀方式要统一。振打次数、混匀时间和沉降时间不同，会影响微生物洗脱效果。

第四，倾注平板时营养琼脂温度不宜过高。温度过高会损伤细菌，过低则易提前凝固。

第五，致病菌检测必须设置阳性和阴性对照，尤其是血浆凝固酶、杆菌肽敏感和链激酶试验。

第六，典型菌落只能作为可疑结果，不能直接报告阳性。必须结合染色、生化和确认试验。

第七，若检测结果接近限值或超过限值，应按标准或企业文件要求进行复测、留样复核和原因调查。

结语

皱纹纸微生物检验的核心，是通过规范采样和样品洗脱，评价产品中一般细菌污染水平，并筛查大肠菌群、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌等卫生相关指标。原文节选中的方法框架清晰，适合用于理解纸类产品微生物检验的基本流程，但需要注意其标准年代较早，部分术语和鉴定方法与现代实验室体系存在差异。

对生产企业而言，微生物控制不能只依赖成品抽检。更重要的是控制原纸、包装材料、生产环境、人员卫生、设备清洁、洁净操作和仓储条件。对实验室而言，关键是保证无菌采样、样液制备一致、平板计数规范、可疑菌落必须确证，避免将初筛现象直接等同于最终检出结果。