菌落总数测定中的误操作及避免方法

菌落总数是食品微生物检验中最常用的卫生指示指标之一。它反映的是食品检样在规定培养基、培养温度和培养时间等条件下，每克或每毫升样品中形成的微生物菌落总数。需要注意的是，菌落总数不是“食品中所有细菌的总数”，也不是“致病菌数量”，而是在特定方法条件下可形成菌落的需氧或兼性厌氧微生物数量。

菌落总数测定看似基础，但结果很容易受到样品状态、稀释梯度、接种量、培养基温度、混匀程度、培养条件、计数规则和报告方式影响。GB 4789.2-2022 已明确菌落总数测定方法，并规定可选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。 因此，减少误操作的关键，是让每一步都可控、可追溯、符合标准。

一、样品制备：代表性比“取够量”更重要

菌落总数测定的第一步是样品制备。样品是否具有代表性，直接决定结果是否可信。固体样品应从不同部位取样并充分混匀；液体样品应充分振摇；含颗粒、油脂、沉淀或分层的样品，应先均质后再取样。若只从表面、边角或某一局部取样，结果可能明显偏高或偏低。

冷冻样品尤其要注意。解冻时间过长、温度过高，可能导致微生物增殖；反复冻融又可能造成菌体损伤或死亡。检测记录中应保留样品接收状态、保存温度、解冻方式和处理时间。

二、稀释液选择：不能所有样品都用同一种方式

不同食品基质对微生物存活和恢复影响不同。酸性、高盐、高糖、高脂、含防腐剂、含酒精或含二氧化碳的样品，如果前处理不当，会导致菌落总数偏低。

旧文中“酸性样品用20%～30%碳酸钠调至中性”“高盐样品用灭菌蒸馏水稀释”等表述，不宜作为通用建议。正式检验应按对应食品类别采样处理标准、GB 4789.2-2022、GB 4789.1-2016和实验室确认过的SOP执行。GB 4789.1-2016规定了食品微生物学检验的基本原则和要求，包括人员、环境、设备和防止人为污染等基本要求。

三、稀释倍数：过大和过小都会出问题

稀释梯度选择不合适，是菌落总数测定中最常见的误差来源之一。稀释度过低，平板菌落过密，容易“多不可计”；稀释度过高，菌落过少，统计代表性不足。理想情况是至少有合适稀释度落入标准推荐计数范围。

GB 4789.2-2022 在方法中列出恒温培养箱、48℃±2℃恒温装置、平板计数琼脂、无菌磷酸盐缓冲液等要求，并增加了菌落总数测试片相关内容。 实验室应根据样品类别、历史数据和标准要求选择1～3个合适稀释度，而不是固定套用某两个梯度。

四、接种操作：严禁口吸移液

旧文中提到“用嘴吸取移液管”，这是必须纠正的高风险错误。现代实验室严禁口吸移液，应使用微量移液器、无菌吸头、移液管和移液辅助器。口吸移液可能导致人员暴露、样品污染、交叉污染和结果失真，完全不符合现代实验室生物安全和质量管理要求。

接种过程的基本原则是：体积准确、样品均匀、无菌操作、标识清楚、过程快速。

五、倾注培养基：温度和时间都要控制

平板倾注法中，培养基温度过高会热损伤细菌，使结果偏低；温度过低则容易提前凝固，导致样液和琼脂混合不均。GB 4789.2-2022 将相关恒温装置要求设为48℃±2℃，实验室应对保温装置进行校准和日常监控。

倾注后应轻柔旋转平皿，使样液与培养基充分混匀。动作要平稳，避免液体溅到皿盖或平皿边缘。

六、培养过程：温度、时间和倒置培养不能随意

菌落总数测定的培养条件应按GB 4789.2-2022或相应产品标准执行。不同食品类别可能有不同培养温度和时间要求。培养箱温度偏高或偏低，都会影响菌落形成速度、菌落大小和最终计数。

培养箱应定期校准和进行温度分布确认；日常运行应记录实际温度，不应只写“符合要求”。

七、灭菌和空白：污染控制要有证据

菌落总数测定用到的培养基、稀释液、吸头、平皿、移液管、均质袋和器具都可能成为污染来源。灭菌是否有效，不能只看“高压锅运行过”，而应通过灭菌记录、指示剂、培养基无菌性检查和空白对照进行证明。

旧文中“170℃烘烤3小时以上”等不应作为所有器具通用要求。不同材料、包装方式和灭菌设备要求不同，应按设备说明、标准方法和实验室确认过的灭菌程序执行。GB 4789.28-2024 适用于食品微生物学检验用培养基和试剂的质量控制，是培养基和试剂验收、质控的重要依据。

八、菌落计数：要按规则，不凭感觉

培养结束后应在规定时间内计数。计数过早，小菌落可能未充分显现；计数过晚，菌落可能增大、融合或蔓延。计数时应记录稀释倍数、平板编号、菌落数、是否有蔓延菌落、是否采用半板计数等信息。

GB 4789.2-2022规定，可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，并记录稀释倍数和相应菌落数量；菌落计数以CFU表示。 计数不是越精细越好，而是要符合标准规则和统计意义。

九、结果报告：不能简单写“未检出”

菌落总数测定是定量检测，结果表达应符合标准要求。若所有平板均无菌落生长，不宜简单报告“未检出”，而应按最低稀释度和方法检出限表达，例如“＜1 CFU/mL”或“＜10 CFU/g”等，具体取决于样品类型、接种量和初始稀释倍数。

报告中应明确单位为CFU/g或CFU/mL。若结果用于产品标准判定，还应注意有效数字、修约规则和限量标准的表达方式。

十、常见误操作汇总

十一、对培养基企业的启示

菌落总数测定常用平板计数琼脂培养基，也可按标准使用符合要求的菌落总数测试片。对培养基企业而言，该项目看似基础，却最能反映培养基批间稳定性和用户操作友好性。

菌落总数培养基不能只评价标准菌株能否生长，还应关注真实食品样品中的受冷、受热、受酸、受盐损伤菌恢复能力。

十二、旧文中的重点修正

十三、小结

菌落总数测定是食品微生物检验中的基础项目，但基础并不等于简单。样品代表性、稀释梯度、移液准确性、倾注温度、培养条件、空白控制、菌落计数和结果报告，任何一个环节失控都会影响最终数据。

对检测实验室而言，应按GB 4789.2-2022、GB 4789.1-2016和相关产品采样处理标准执行，严禁口吸移液，规范空白和质控，按标准表达结果。对培养基企业而言，菌落总数测定提示我们：平板计数琼脂不仅要支持生长，还要在澄清度、凝胶强度、pH、批间一致性和受损菌恢复方面保持稳定。只有方法规范和培养基可靠同时满足，菌落总数结果才真正具有可比性和质量意义。