食品微生物学检验中双歧杆菌的鉴定方法

双歧杆菌（Bifidobacterium）是食品和益生菌产品中常见的重要功能菌群，广泛用于发酵乳、益生菌粉、固体饮料及相关食品配料中。由于双歧杆菌对氧较敏感，形态多变，且不同种之间生化特征存在交叉，仅凭菌落形态或简单镜检不能可靠完成鉴定。食品微生物学检验中，通常需要结合厌氧培养、形态观察、生化反应以及有机酸代谢特征进行综合判断。

现行GB 4789.34—2016已将原“食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定”调整为“食品微生物学检验 双歧杆菌检验”，内容不仅包括双歧杆菌鉴定，也包括计数方法。其适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数，也适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定；对于计数，可用于食品中仅含双歧杆菌属的样品，即样品中可包含一个或多个不同双歧杆菌菌种。

一、检验思路：先分离纯培养，再进行综合鉴定

双歧杆菌鉴定的基本流程为：样品制备、接种培养、挑取可疑菌落纯培养、涂片镜检、生化鉴定，必要时进行有机酸代谢产物测定。对于食品样品，一般以无菌操作称取25.0 g或量取25.0 mL样品，加入225.0 mL灭菌生理盐水或其他适宜稀释液中，制成1:10样品匀液。冷冻样品应在2～5℃条件下缓慢解冻，或在不超过45℃条件下短时间解冻，避免高温和长时间暴露影响活菌状态。

样品匀液可直接接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板，也可根据样品中活菌量进行10倍系列稀释后涂布或倾注培养。培养条件通常为36℃±1℃厌氧培养48 h±2 h，必要时可延长至72 h±2 h。培养后挑取3个或以上单个菌落，重新接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板进行纯培养，再用于后续鉴定。

二、典型形态与初步鉴定特征

双歧杆菌为革兰氏阳性菌，不抗酸，无芽孢，无动力。镜检时菌体形态多样，可呈短杆状、纤细杆状、球杆状，也可出现分支、分叉或“Y”形等多形态结构。由于培养基组成、培养时间和菌株差异会影响形态表现，不能只根据是否出现分叉形态判断是否为双歧杆菌。

生化鉴定中，过氧化氢酶试验通常为阴性。不同双歧杆菌种可通过糖类发酵或底物利用谱进行区分，例如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、木糖、阿拉伯糖、七叶灵等项目可用于辅助鉴别两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌等常见种。但双歧杆菌属内种间差异并非绝对，部分项目会出现菌株差异，因此报告种名时应结合多项结果综合判定，必要时使用生化鉴定试剂盒、全自动微生物生化鉴定系统或分子生物学方法进一步确认。

三、有机酸代谢产物：双歧杆菌的重要判定依据

双歧杆菌具有典型的“双歧途径”糖代谢特征，发酵糖类后主要产生乙酸和乳酸。检验中可测定培养液中的有机酸代谢产物，当乙酸与乳酸的微摩尔浓度比值大于1时，可作为双歧杆菌代谢特征的重要依据。

有机酸测定通常先将纯培养菌接种于PYG液体培养基中，36℃±1℃厌氧培养48 h，再对培养液中的乙酸和乳酸进行检测。旧版资料中常见气相色谱法表述，现行标准中有机酸测定已作为可选项目，且方法口径更偏向色谱定量分析。实际检验时，应根据实验室现行有效标准文本、设备配置和方法验证情况执行，不宜将单一有机酸比值作为唯一鉴定依据。

四、双歧杆菌琼脂培养基的组成与作用

双歧杆菌培养基需要同时满足营养丰富、适合厌氧菌生长、氧化还原环境较低等要求。配方中蛋白胨、酵母浸膏和西红柿浸出液提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖为主要可发酵碳源；半胱氨酸盐有助于降低氧化还原电位，改善双歧杆菌生长环境；吐温80可提供脂肪酸来源并改善部分菌株生长。

制备时，西红柿浸出液可由新鲜西红柿切碎后加等量蒸馏水，于100℃水浴中加热搅拌约90 min，过滤后校正pH至7.0左右，再经121℃灭菌15～20 min备用。培养基全部成分溶解后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH至6.8左右，分装后121℃高压灭菌15～20 min。由于双歧杆菌对氧敏感，平板制备后应尽量减少长时间暴露空气，必要时进行预还原处理。

五、PYG液体培养基的用途与制备注意

PYG液体培养基主要用于双歧杆菌有机酸代谢产物测定前的培养。其营养较丰富，含蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、半胱氨酸-HCl、盐溶液、维生素K1和氯化血红素等成分，可支持厌氧或兼性厌氧微生物生长。

需要注意的是，氯化血红素溶液若标注为5 mg/mL，称取0.5 g氯化血红素后应定容至100 mL；若定容至1000 mL，则实际浓度仅为0.5 mg/mL。维生素K1溶液应过滤除菌、避光冷藏保存，不宜与基础培养基一起高压灭菌。PYG为液体培养基，配方中不含琼脂，制备说明中如出现“临用时加热熔化琼脂”等表述，应视为旧资料或排版转录错误，实际操作应按液体培养基处理。

六、结果报告与质量控制要点

双歧杆菌鉴定结果应综合涂片镜检、生化反应和必要的有机酸代谢产物结果进行报告。符合双歧杆菌典型形态、革兰氏阳性、不抗酸、无芽孢、无动力、过氧化氢酶阴性，并具有相应生化反应谱和乙酸/乳酸比值特征时，可报告双歧杆菌属或进一步报告种名。

对于食品或益生菌产品检验，关键控制点包括：样品处理必须全程无菌；培养过程必须满足厌氧条件；平板培养时间不宜过短；挑取菌落必须经过纯培养；生化反应应使用新鲜、纯净菌落；有机酸测定应设置未接种PYG空白对照。若样品中存在多种益生菌或伴随乳酸菌，单纯依靠平板形态和产酸现象容易误判，应通过纯培养和多指标鉴定排除干扰。

双歧杆菌检验的核心不是“看到分叉杆菌”就下结论，而是将培养特性、细胞形态、生化反应和代谢产物组合起来判断。对于益生菌食品、菌粉原料和发酵制品，规范的双歧杆菌鉴定不仅关系到产品标识真实性，也直接影响活菌质量评价和产品稳定性研究。