食品微生物学检验中克罗诺杆菌的检验方法

克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）过去常以“阪崎肠杆菌”名称出现在食品微生物检验资料中，是婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中重点关注的条件致病菌。由于该菌可在低水分食品中保持较强存活能力，并且目标样品中菌量可能较低，因此检验时通常需要经过前增菌、选择性增菌、选择性分离和确证鉴定等步骤。

现行检验标准已不再以“阪崎肠杆菌检验”作为标准名称，而采用“克罗诺杆菌检验”的表述。旧版资料中“Enterobacter sakazakii”“阪崎肠杆菌显色培养基”“TSA上挑取黄色可疑菌落”等表述应作相应更新，实际检验应以现行有效标准为准。

一、检验原理：先复苏，再选择性富集，最后分离确证

克罗诺杆菌检验的核心思路是：先用缓冲蛋白胨水（BPW）对样品中可能受损或低水平存在的目标菌进行复苏和前增菌，再转入含万古霉素的改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（mLST-Vm）进行选择性增菌，随后接种克罗诺杆菌显色培养基分离可疑菌落，最后通过TSA纯化、生化鉴定或选做PCR鉴定进行确证。

前增菌阶段不能过强抑制目标菌，否则会降低检出率；选择性增菌阶段则需要抑制部分伴生菌，提高目标菌分离概率。mLST-Vm中高浓度氯化钠、十二烷基硫酸钠及万古霉素共同构成选择压力，其中万古霉素主要用于抑制部分革兰氏阳性杂菌，对克罗诺杆菌等革兰氏阴性肠杆菌科细菌影响较小。

二、定性检验流程

定性检验通常取检样100 g或100 mL，加入已预热的BPW中，充分混匀后进行前增菌培养。旧版资料中BPW预热温度常写为44℃，但现行标准已调整为41℃±1℃；选择性增菌mLST-Vm的培养温度也由旧版44℃±0.5℃调整为41.5℃±1℃。这一调整的意义在于降低高温对受损菌的额外抑制，提高样品中低水平或受损克罗诺杆菌的恢复机会。

前增菌后，取培养物转种至mLST-Vm肉汤中，于41.5℃±1℃进行选择性增菌。增菌完成后，将培养物划线接种于克罗诺杆菌显色培养基平板，36℃±1℃培养。显色培养基可利用克罗诺杆菌的酶学特征形成特征性菌落，便于从复杂背景菌中筛选可疑菌落。

分离得到的可疑菌落需转接至TSA平板进行纯化。旧版资料中TSA常采用25℃±1℃培养48 h±4 h，并强调挑取黄色菌落；现行标准已将TSA培养条件调整为36℃±1℃培养24 h±2 h，并删除“产黄色素”作为关键判定项目。原因是并非所有克罗诺杆菌都稳定产黄色素，单纯依赖黄色菌落可能造成漏检。

三、计数方法：MPN用于低水平污染样品评价

对于需要定量评价的样品，可采用三管法最可能数（MPN）进行计数。固体或半固体样品可分别取100 g、10 g、1 g各三份，液体样品可分别取100 mL、10 mL、1 mL各三份，加入相应体积BPW中制成1:10样品匀液并进行前增菌。随后按定性检验流程转种mLST-Vm、分离、确证，根据各稀释水平的阳性管数查MPN表，报告每100 g或100 mL样品中克罗诺杆菌的MPN值。

MPN法适合目标菌含量较低、样品基质复杂或需要报告概率估计值的场景。其结果依赖于阳性管确证的准确性，因此不能只根据显色平板上的可疑菌落直接计数，必须经过后续鉴定确认。

四、主要培养基与作用

BPW制备时通常含蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成的缓冲体系，pH约7.2。mLST基础配方中氯化钠含量较高，配合十二烷基硫酸钠形成选择性环境；万古霉素应过滤除菌后无菌加入，配制后的mLST-Vm不宜长期放置。TSA作为非选择性营养培养基，主要用于恢复和纯化可疑菌落，保证后续生化或分子鉴定使用新鲜纯培养物。

五、确证鉴定：不能只看显色和黄色素

克罗诺杆菌显色培养基能提高筛选效率，但显色结果只能作为可疑判断，不能直接作为最终确证依据。确证时可采用传统生化鉴定、商品化生化鉴定试剂盒、微生物生化鉴定系统，或按标准选做PCR鉴定。

传统生化项目中，克罗诺杆菌通常表现为氧化酶阴性，并具有一定的氨基酸代谢、糖发酵和柠檬酸盐利用特征。旧版资料中将TSA上产黄色素作为重要筛选依据，但这一项目已不再适合作为关键判定点，因为部分克罗诺杆菌不稳定产黄色素，过度依赖该特征会增加漏检风险。新版方法更强调从显色培养基上挑取可疑菌落，经TSA纯化后结合生化或PCR结果进行确认。

如果选做PCR鉴定，可先对可疑菌落进行PCR筛选；PCR阴性的菌落通常不再进入后续生化确证，PCR阳性的菌落再进行必要的确证试验。对于阳性样品，只要从可疑菌落中确证出克罗诺杆菌，即可按对应检验程序报告阳性或进行MPN计数。

六、结果报告与质量控制要点

定性检验中，如经前增菌、选择性增菌、显色分离和确证鉴定后检出克罗诺杆菌，应报告样品中检出克罗诺杆菌；未检出时，则按规定报告未检出。计数检验中，应根据各稀释水平阳性管数查MPN检索表，报告每100 g或每100 mL样品中克罗诺杆菌MPN值。

检验过程中应重点控制四个环节：第一，BPW和mLST-Vm温度不能沿用旧版44℃条件，应按现行标准执行；第二，mLST-Vm中万古霉素需过滤除菌后加入，且配制后应在规定时间内使用；第三，显色平板上的可疑菌落必须进一步纯化和确证，不能只凭颜色直接报告；第四，TSA上是否产黄色素不应再作为是否鉴定的决定性依据。

克罗诺杆菌检验的难点不在于单个步骤复杂，而在于样品中目标菌可能含量低、状态受损且伴生菌背景复杂。规范的前增菌、合适的选择性增菌温度、可靠的显色分离和严谨的确证鉴定，才是保证检出率和结果准确性的关键。