非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法要点解析

非无菌产品并不要求完全无菌，但必须控制微生物污染水平，避免产品在生产、贮存和使用过程中因微生物超标而影响质量和安全性。微生物计数法主要用于检查非无菌制剂及其原料、辅料中能在有氧条件下生长的嗜温细菌、霉菌和酵母菌数量，常见指标包括需氧菌总数和霉菌、酵母菌总数。

需要注意的是，微生物计数法一般不适用于活菌制剂。对于益生菌、活菌药品或含特定活微生物的产品，应采用与其产品属性相匹配的专门方法，而不能简单套用普通非无菌产品微生物限度检查。

一、检查目的：不是“有没有菌”，而是“菌数是否受控”

非无菌产品微生物限度检查的核心，是判断产品中的微生物污染水平是否符合规定限度。其重点不是像无菌检查那样判断“有无微生物生长”，而是通过适当方法获得可计数结果，并据此评价产品质量。

微生物计数试验必须在符合微生物限度检查要求的环境中进行。检验全过程应严格执行无菌操作，防止外来污染导致结果偏高。同时，防污染措施又不能影响供试品中微生物的检出。例如消毒剂残留、过度加热、过滤压力过高、冲洗液不合适，都可能造成微生物损伤，导致结果偏低。

如果供试品本身具有抗菌活性，应尽可能通过稀释、中和、灭活或薄膜过滤等方式去除干扰。若使用中和剂、灭活剂或表面活性剂，还必须确认其有效性、无毒性以及相互兼容性，不能只看其能否消除供试品抑菌作用。

二、常用计数方法：平皿法、薄膜过滤法和MPN法

微生物计数法常用三类方法：平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。具体选择应根据供试品的理化性质、微生物限度标准、抑菌性、溶解性、过滤性和预期污染水平确定。

平皿法又分为倾注法和涂布法。倾注法通常取供试液1 mL加入无菌平皿，再加入不超过45℃的熔化培养基混匀；涂布法则将供试液接种于已凝固并适当干燥的培养基表面。涂布法对热敏性微生物损伤较小，但接种体积通常较小；倾注法接种量较大，但温度控制不当可能影响微生物恢复。

薄膜过滤法通常采用孔径不大于0.45 μm的滤膜。过滤前应确认滤膜材质不会吸附或抑制微生物，样品和溶剂不会破坏滤膜完整性。过滤后可用适宜冲洗液冲洗滤膜，以去除供试品中的抑菌成分，但总冲洗量不宜无限增加，避免造成滤膜上微生物损伤。

MPN法属于概率估计方法，结果精密度和准确度不如平皿法与薄膜过滤法。它通常只在需氧菌总数没有更适合计数方法时使用，不宜作为常规首选方法。

三、培养基适用性：培养基必须先证明“养得出菌”

微生物计数用培养基无论是成品培养基、脱水培养基，还是按处方自行配制的培养基，都应进行培养基适用性检查。其目的不是检查培养基配方是否“看起来正确”，而是证明该批培养基能支持规定试验菌正常生长。

常用培养基包括胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。胰酪大豆胨培养基主要用于需氧菌总数检查，沙氏葡萄糖琼脂培养基主要用于霉菌和酵母菌总数检查。

培养基适用性检查中，固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数比值应在规定范围内，通常为0.5～2.0，且菌落形态应基本一致。液体培养基则应与对照培养基比较，试验菌生长良好。若培养基不能支持低菌量试验菌生长，则该培养基不应直接用于供试品检查。

四、供试液制备：不同剂型不能“一种方法通用”

供试液制备是微生物计数成败的关键步骤。供试液应尽可能均匀、可操作，并能释放产品中可能存在的微生物。制备过程中如需加温，应均匀加热，温度一般不应超过45℃。供试液从制备到加入检验用培养基的时间应尽量缩短，通常不应超过1小时。

水溶性供试品可用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH 7.2磷酸盐缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释，制成1:10供试液。必要时调节pH至6～8，并进行10倍系列稀释。

水不溶性非油脂类供试品可用上述稀释液制备成悬液。若分散性较差，可加入经确认无抑菌性的表面活性剂，如适量聚山梨酯80，使供试品分散均匀。

油脂类供试品可先用无菌十四烷酸异丙酯溶解，或用最少量无菌聚山梨酯80等无抑菌性表面活性剂乳化，再加入预热稀释液制成1:10乳状供试液。乳化过程应避免温度过高和长时间处理，以免损伤污染微生物。

特殊剂型需采用相应处理方式。例如膜剂可剪碎后浸泡、振摇；肠溶制剂可用pH 6.8无菌磷酸盐缓冲液处理；结肠溶制剂可用pH 7.6无菌磷酸盐缓冲液处理；气雾剂和喷雾剂应在安全释放抛射剂后取样；贴膏剂应去除防粘层，并在含适宜表面活性剂的稀释液中充分振荡，使粘附面上的微生物尽可能释放。

五、方法适用性试验：确认产品不干扰计数

供试品的计数方法必须进行方法适用性试验。其目的，是证明所选供试液制备方法、抗菌活性去除方式和计数方法能够在该产品中有效回收微生物。

方法适用性试验通常包括试验组、供试品对照组和菌液对照组。试验组是在供试液中加入规定低水平试验菌；供试品对照组用于确认供试品本底菌数；菌液对照组用于确认试验菌在无供试品干扰条件下的正常回收。加入菌液的体积通常不应超过供试液体积的1%，以避免稀释体系被明显改变。

采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数后的结果，与菌液对照组菌落数的比值应符合规定范围，通常为0.5～2.0。若采用MPN法，试验组结果应在菌液对照组结果的相应置信范围内。

若试验菌回收不合格，说明供试品、稀释体系、表面活性剂、滤膜、冲洗液或操作过程可能存在干扰，需要优化方法，而不能直接用于正式检验。

六、抗菌活性如何去除或中和？

很多非无菌产品具有一定抗菌活性，例如含防腐剂、表面活性剂、植物提取物、醇类、季铵盐、碘类、金属盐、有机酸或抗菌药物成分的产品。这类样品若不消除抑菌作用，可能出现菌数偏低，甚至造成假阴性。

常用处理思路包括增加稀释倍数、增加培养基或稀释液体积、加入适宜中和剂或灭活剂、采用薄膜过滤法冲洗去除抑菌物，或几种方法联合使用。常见中和体系可包括卵磷脂、聚山梨酯80、硫代硫酸钠、组氨酸、蛋白胨、半胱氨酸等，但具体选择必须根据供试品抑菌成分和方法适用性结果确定。

需要强调的是，中和剂不是加得越多越好。中和剂本身可能对某些微生物有毒性，也可能影响培养基凝固、菌落形态或结果判读。因此，使用中和剂或灭活剂时，应设置相应对照，确认其既能有效中和供试品抑菌性，又不会抑制试验菌生长。

如果多种方法仍无法使某一试验菌回收达到要求，应选择回收最接近要求且具有科学合理性的条件进行检查，并结合该产品的微生物限度标准和风险进行判断。不能因为供试品对某一质控菌有强抑制作用，就直接推断产品不会受其他微生物污染。

七、正式检查与结果判断

当培养基适用性和计数方法适用性均符合要求后，才能按确认的方法进行供试品检查。正式检查时，应根据供试品限度选择适当取样量和稀释级，确保结果能够判断产品是否符合规定。

需氧菌总数通常使用胰酪大豆胨琼脂培养基培养，霉菌和酵母菌总数通常使用沙氏葡萄糖琼脂培养基培养。培养后选择合适菌落数范围的平皿或滤膜进行计数，结合稀释倍数换算为每克、每毫升或每单位面积供试品中的菌数。若样品本底菌落数较高，应选择可计数范围内的稀释级；若菌数很低，应保证检测样品量足以支持限度判断。

阴性对照必须无菌生长。如阴性对照出现生长，应进行偏差调查，评估环境、稀释液、培养基、器具、人员操作和交叉污染风险，不能简单忽略。

八、对培养基和试剂企业的启示

对于培养基、缓冲液、采样液、生化鉴定试剂和非无菌生命科学试剂企业，微生物限度检查不仅是成品放行项目，也是工艺卫生水平和质量体系稳定性的反映。若产品微生物计数异常，应从原辅料、水系统、配料环境、设备清洁、包装材料、灌装过程和贮存条件系统排查。

培养基类产品还应特别关注两点：第一，产品中的营养成分可能促进污染微生物生长，因此生产和包装过程必须控制初始污染；第二，部分培养基或试剂含有抑菌剂、选择剂、染料、胆盐、表面活性剂或防腐成分，微生物限度检查时更需要进行方法适用性确认，避免抑菌成分造成低估。

微生物计数法的关键不是机械完成“稀释、接种、培养、计数”，而是证明所用方法能真实反映产品中的微生物污染水平。只有培养基适用、供试液制备合理、抑菌作用得到控制、回收率符合要求，最终计数结果才具有质量判断价值。

结语

非无菌产品微生物限度检查的微生物计数法，是非无菌产品质量控制的重要工具。它既要防止外来污染导致结果虚高，也要防止供试品抑菌性、过滤损伤或方法不适用导致结果虚低。

规范的微生物计数检查应以方法适用性为前提，以培养基适用性为基础，以合理的供试液制备和抗菌活性控制为关键。对于企业而言，真正有价值的不是得到一个菌数结果，而是建立一套能够稳定、准确反映产品微生物污染水平的检验方法。