GB 4789.44—2020 创伤弧菌检验方法解析：水产品样品处理、PCR筛查与分离鉴定

创伤弧菌，学名 Vibrio vulnificus，是一类嗜盐性弧菌，常存在于温暖海水、近岸水体及贝类、虾蟹、鱼类等水产品中。它是水产品微生物安全中需要重点关注的病原菌之一，尤其与生食或未充分加热的海产品、贝类摄入以及开放性伤口接触海水或海产品有关。创伤弧菌感染虽不如副溶血性弧菌常见，但一旦发生，进展可较快，对肝病、免疫功能低下、老年人等高风险人群危害更大。

GB 4789.44—2020《食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验》规定了水产品中创伤弧菌的检验方法，适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品。该方法的特点是将传统培养分离、生化鉴定与 PCR 检测结合使用：样品先经 PNCC 增菌，再可进行 PCR 筛查，同时用 CC 和 mCPC 平板分离可疑菌落，最后通过菌落特征、生化特性或 PCR 鉴定结果报告 25 g 样品中是否检出创伤弧菌。

一、为什么创伤弧菌样品不能简单放 4℃？

创伤弧菌检验中有一个非常重要的前处理要求：新鲜样品采集后应尽量在 3 h 内完成检验；若不能及时检测，应置于 7℃～10℃保存，并尽可能在 24 h 内完成检验，不宜置于 4℃条件下。

原因在于创伤弧菌在低温，尤其是 4℃附近，容易进入“活而不可培养”状态，即细菌仍可能具有活性，但在常规培养基上难以形成可见菌落。如果样品直接低温冷藏至 4℃，可能导致培养法检出率下降，造成假阴性风险。因此，GB 4789.44—2020 明确提示样品勿放 4℃条件下保存。

冷冻样品也应注意解冻方式。标准要求冷冻样品在不超过 45℃ 的温热条件下解冻，解冻时间不超过 15 min。解冻过慢、反复冻融或温度控制不当，都会影响目标菌状态和后续检出。

二、方法流程概述

创伤弧菌检验流程可概括为：样品制备、PNCC 增菌、PCR 检测、选择性分离、分纯培养、生化或 PCR 鉴定，以及可选的分型试验。

这种“增菌 + 分离 + PCR/生化确认”的组合流程，有助于兼顾灵敏度和准确性。PCR 可提高筛查速度，但培养分离仍有助于获得菌株，用于后续鉴定、分型和溯源分析。

三、样品取样与制备

不同水产品取样部位不同。鱼类和头足类取表面组织、肠和鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物或中心部分，包括肠和鳃。若样品为带壳贝类或硬壳甲壳类，应先用流动自来水冲洗外壳，并用滤纸吸干表面水分，再无菌打开外壳，按要求取样。

无菌操作取处理后的样品 25 g，加入 225 mL PNCC 增菌液，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min 均质1 min，或用拍击式均质器均质 2 min，充分混匀，制备成 1:10 样品匀液。若无均质器，可将样品置无菌乳钵充分研磨，再取磨碎样品 25 g 转入 500 mL 无菌锥形瓶，加入 225 mL PNCC 增菌液，充分振荡混匀。

贝类样品中体液和组织均可能含有目标菌，因此取样时不应只取贝肉而忽略体液。甲壳类样品则应关注肠和鳃等富集微生物的部位。

四、PNCC 增菌：提高目标菌恢复和检出率

将制备好的 1:10 样品匀液置 36℃±1℃培养18 h±1 h。PNCC 增菌液全称为蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E增菌液，其设计思路是利用创伤弧菌对盐分和纤维二糖的利用特征，同时通过多黏菌素E对部分背景菌形成选择压力。

PNCC 增菌的作用包括：恢复受损细胞、提高低水平目标菌数量、降低背景菌干扰，并为后续 PCR 和选择性分离提供较高目标菌丰度。对于新鲜水产品、贝类和冷冻样品，增菌步骤对提高检出率非常关键。

五、增菌液 PCR 检测：快速筛查目标基因

标准中设置了增菌液 PCR 检测步骤。DNA 模板制备时，在距离 PNCC 增菌液液面下约 1 cm 处吸取 1 mL，置 1.5 mL EP 管中，9000 r/min 离心 3 min，弃上清。用 1 mL PBS 悬浮沉淀并清洗，重复清洗 2～3 次，最后加入 1 mL 无菌超纯水，100℃煮沸 10 min，再以 12000 r/min 离心 5 min，取上清液用于 PCR 分析。也可使用商品化 DNA 提取试剂盒按说明书制备模板。

PCR 反应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照使用创伤弧菌标准菌株；阴性对照使用除创伤弧菌之外的其他弧菌标准菌株；空白对照使用灭菌去离子水。PCR 程序通常包括 94℃预变性 5 min，随后 30 个循环：94℃ 1 min、62℃ 1 min、72℃ 1 min，最终 72℃延伸 10 min。扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

在质控系统正常的前提下，若样品出现预期大小 519 bp 的扩增条带，判定 PCR 结果阳性；若未出现该条带，判定 PCR 结果阴性。若阳性对照、阴性对照或空白对照结果异常，应重做实验，并排查污染、试剂失效或扩增失败等问题。

PCR 筛查速度快，但不能完全替代培养分离。若需要获得菌株用于进一步鉴定、分型、药敏、溯源或保存，仍需进行分离培养。

六、选择性分离：CC 与 mCPC 平板

用 10 μL 接种环在距离 PNCC 增菌液液面下约 1 cm 处沾取一环增菌液，分别划线接种于 CC 琼脂平板和 mCPC 琼脂平板，置 36℃±1℃培养18 h±1 h。

创伤弧菌在 CC 和 mCPC 平板上的典型菌落为：圆形、扁平，在光照下呈透明或中心不透明但边缘透明，颜色为黄色至橘黄色，直径约 1 mm～2 mm，菌落周围可出现或不出现黄色晕圈。

CC 和 mCPC 培养基均利用纤维二糖及多黏菌素类抗生素形成选择和鉴别作用。平板上出现的黄色至橘黄色可疑菌落，应进入后续分纯和鉴定流程。由于其他弧菌或背景菌也可能形成相似菌落，不能仅凭选择性平板菌落颜色直接报告检出。

七、分纯培养：3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂

从 CC 平板和 mCPC 平板上各挑取至少 5 个创伤弧菌可疑菌落；若可疑菌落少于 5 个，则全部挑取。将其分别接种于 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，置 36℃±1℃培养18 h±1 h 后用于后续鉴定。

创伤弧菌在 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂上的菌落通常为 圆形、乳白色、湿润、隆起，直径约 1 mm～2 mm。3%氯化钠的加入是因为创伤弧菌具有嗜盐性，适当盐浓度有利于其生长和恢复。

分纯培养的目的，是获得来自同一单菌落的纯培养物。后续革兰染色、氧化酶、TSI、嗜盐性、生化或 PCR 鉴定均应尽量使用同一纯培养菌落，避免混合菌造成结果矛盾。

八、初步鉴定：革兰染色、氧化酶、TSI 与嗜盐性

创伤弧菌的初步鉴定通常包括四项：革兰氏染色、氧化酶试验、3%氯化钠三糖铁琼脂试验和嗜盐性试验。

氧化酶试验应使用新鲜试剂，并在规定时间内判读。TSI 接种时需穿刺底层并划线斜面，接种针不应触及试管底部。嗜盐性试验应同时设置不同盐浓度胰蛋白胨水，观察 24 h 后液体混浊程度。

九、确证试验：生化鉴定或 PCR 鉴定

将初步鉴定为创伤弧菌的疑似菌落接种至 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养 18 h±1 h 后，取纯培养物进行确证试验。

传统生化鉴定包括 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验、3%氯化钠 MR-VP 培养基、ONPG 试验等，也可选择商品化生化鉴定试剂盒。由于弧菌属内不同种之间生化特征相近，建议将初步鉴定结果、生化谱和选择性平板特征结合判断。

标准也允许使用 PCR 方法替代生化鉴定进行快速确认。PCR 鉴定时，从 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取疑似菌落，置 500 μL 无菌超纯水中制成肉眼可见混浊菌悬液，煮沸 10 min，12000 r/min 离心 5 min，取上清液作为模板。扩增、电泳和结果判定与增菌液 PCR 检测一致。在质控正常时，待测菌株出现 519 bp 目标条带，即判定该菌株为创伤弧菌；未出现则判定不是创伤弧菌。

十、PCR分型：可选的流行病学信息

创伤弧菌分型为选做项目，通常用于风险评估、溯源分析或流行病学研究。分型 PCR 可针对 vcg、16S rRNA、Bt2、SerE 等基因进行扩增。

在质控系统正常的情况下，若待测菌株出现 97 bp 条带，可判定为 vcg C 型；出现 199 bp 条带，可判定为 vcg E 型。若出现 285 bp 条带，可判定为 16S rRNA A 型；出现 839 bp 条带，可判定为 16S rRNA B 型；若同时出现 285 bp 和 839 bp 两条带，可判定为 16S rRNA A/B 型。若出现 665 bp 条带，可判定为血清 E 型；若出现 344 bp 条带，可判定为生物 1 型。

分型结果不是“检出/未检出”的必要条件，而是对已确认创伤弧菌菌株进行进一步分群。日常监督检测中，应根据检测目的和实验室能力选择是否开展。

十一、结果报告规则

根据菌落特征、生化特性或 PCR 鉴定结果，报告 25 g 样品中检出或未检出创伤弧菌。

需要注意，增菌液 PCR 阳性说明样品增菌液中存在目标基因信号，但在需要按标准报告“检出创伤弧菌”时，应结合标准规定的分离、确认流程执行。若 PCR 阳性但未分离到菌株，应按实验室 SOP 和标准判定要求谨慎处理，并在记录中说明。

十二、检验用培养基与试剂要点

GB 4789.44—2020 涉及的培养基和试剂较多，不同阶段作用不同。

培养基质量会直接影响检出率。PNCC 增菌液应保证多黏菌素E等选择性成分有效；CC 和 mCPC 平板应新鲜、表面干湿适宜；3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂应能良好支持创伤弧菌生长；PCR 试剂应设置阳性、阴性和空白对照，避免污染和假阴性。

十三、常见问题与注意事项

第一，新鲜样品应尽快检验，不能简单置于 4℃冷藏。创伤弧菌在 4℃条件下易进入活而不可培养状态，可能降低培养检出率。

第二，贝类样品应取全部内容物，包括贝肉和体液。只取部分组织可能导致代表性不足。

第三，PNCC 增菌液应按要求配制和保存。选择性成分失效可能导致背景菌过多，影响分离。

第四，CC 和 mCPC 平板上的黄色至橘黄色菌落只是可疑菌落，不能直接报告创伤弧菌阳性。

第五，分纯培养非常关键。后续革兰染色、氧化酶、TSI、嗜盐性和 PCR 鉴定应尽量来自同一纯培养单菌落。

第六，氧化酶试验应在 10 s 内判读。超时变色可能造成假阳性。

第七，嗜盐性试验应同时观察多个盐浓度，3%和6%氯化钠中生长旺盛是重要特征。

第八，PCR 必须设置阳性、阴性和空白对照。任何对照异常都应重做实验并排查污染或扩增失败。

第九，分型试验是选做项目，不影响常规“检出/未检出”报告，但可用于溯源和风险分析。

十四、小结

GB 4789.44—2020 规定了水产品中创伤弧菌的检验方法。该方法以 PNCC 增菌液制备 1:10 样品匀液，经 36℃±1℃培养18 h±1 h 后，可进行增菌液 PCR 筛查，同时使用 CC 和 mCPC 平板进行选择性分离。可疑菌落经 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂分纯后，再通过革兰染色、氧化酶、TSI、嗜盐性、生化特性或 PCR 方法确认。

该方法的关键控制点包括：样品采后尽快检测，不宜 4℃保存；PNCC 增菌和 CC/mCPC 分离要保证培养基质量；可疑菌落必须分纯后鉴定；PCR 检测需严格设置对照；最终根据菌落特征、生化特性或 PCR 鉴定结果报告 25 g 样品中检出或未检出创伤弧菌。对于水产品生产、检测和监管环节而言，规范执行该方法是识别创伤弧菌风险、保障水产品食用安全的重要基础。