GVPC琼脂基础：用于军团菌选择性分离培养的专用培养基

一、产品用途与基本信息

二、基础配方组成、用量及作用

三、配套试剂组成及作用

按产品说明，每100 mL基础培养基加入1支配套试剂TJ041C。该配套试剂中既含军团菌生长必需或促进性成分，也含选择性抑菌剂。加入配套试剂后若pH不符合要求，可使用KOH进行调整。

注：配套试剂应在基础培养基冷却至约50 ℃时加入，不宜与基础培养基一同高压灭菌，以免抗菌成分和半胱氨酸稳定性受影响。

四、检验原理

GVPC琼脂是在BCYE类军团菌培养基基础上加入选择性抑菌体系形成的培养基。军团菌营养要求特殊，常规培养基通常难以支持其良好生长。酵母提取物为军团菌提供丰富有机营养；盐酸L-半胱氨酸是军团菌生长所需的关键成分；可溶性焦磷酸铁提供铁源；α-酮戊二酸单钾盐可促进代谢和细胞恢复；ACES缓冲体系有助于维持稳定pH；活性炭可吸附培养基中的抑制性物质，减少氧化应激对军团菌生长的影响。

选择性方面，甘氨酸、万古霉素、多黏菌素B和放线菌酮共同抑制样品中的背景微生物。万古霉素主要抑制革兰氏阳性菌，多黏菌素B抑制部分革兰氏阴性菌，放线菌酮抑制真菌，甘氨酸则进一步增强选择性。由于水样和环境样品背景菌复杂，GVPC琼脂的作用是提高军团菌分离机会，但不能单独作为最终确认依据。疑似菌落仍需进行纯化、BCYE有/无半胱氨酸对照、生化或分子确认等步骤。

五、使用方法

称取本品41.0 g，加入蒸馏水或去离子水1 L，充分混匀后分装三角瓶，每瓶100 mL，于121 ℃高压灭菌15 min。灭菌结束后冷却至约50 ℃，每100 mL基础培养基加入1支配套试剂TJ041C，充分混匀后倾注无菌平板。

由于培养基中含有不溶性活性炭，整体呈黑色属于正常现象。倒平板前应轻轻摇匀，使活性炭分布均匀，避免沉降导致平板表面颜色深浅不一或局部成分不均。加入配套试剂后如pH不在规定范围，可用KOH进行调整。平板凝固后应按实验室验证条件保存，并尽量在规定期限内使用。

六、质量控制

注：军团菌生长较慢，培养观察时间通常长于普通细菌。质控时应按规定时间持续观察，避免因观察过早误判为不生长。

七、菌落观察与判读提示

军团菌在GVPC琼脂上通常生长较慢，菌落可呈灰白色、蓝白色或淡灰色，表面湿润，有一定光泽。部分菌株在紫外光下可出现黄绿色、蓝白色等荧光表现。由于培养基背景为黑色，观察菌落时应注意光线角度，并结合放大镜或低倍显微镜观察菌落边缘、质地和荧光特征。

需要注意的是，GVPC平板上的疑似菌落不能仅凭颜色或荧光直接判定为军团菌。完整检测通常需要将疑似菌落转种至含L-半胱氨酸的BCYE培养基和不含L-半胱氨酸的对照培养基。典型军团菌通常在含半胱氨酸培养基上生长，而在不含半胱氨酸培养基上不生长或生长极弱。必要时还需结合血清学、质谱或分子方法确认。

八、常见问题与原因分析

若军团菌质控菌株生长不良，应优先检查盐酸L-半胱氨酸是否正确加入、配套试剂是否失效、pH是否为6.9±0.2、基础培养基是否过度加热、活性炭是否分散均匀，以及培养时间是否足够。军团菌培养周期较长，3天内未出现明显菌落并不一定代表培养基失效，应按方法要求观察至规定终点。

若平板杂菌较多，可能与样品背景菌量过高、样品预处理不足、选择性添加剂失效、平板保存时间过长或培养条件控制不当有关。若平板颜色不均，多与活性炭沉降有关，倒平板前应充分混匀。若加入配套试剂后pH偏离，应按说明用KOH微调，并重新确认pH合格后使用。

九、与军团菌检测流程的关系

GVPC琼脂主要用于环境水样中军团菌的选择性分离。循环冷却水、集中空调冷却水等样品常含有大量异养菌、真菌和颗粒物，直接使用非选择性培养基容易被杂菌覆盖。GVPC通过选择性抑菌体系降低背景菌干扰，使军团菌有机会形成可挑取的疑似菌落。

在实际检测中，GVPC琼脂常与BCYE培养基、样品酸处理或热处理、浓缩过滤、纯化培养和确认试验配合使用。其优势是选择性强、适合复杂水样分离；不足是军团菌生长慢，且部分受损军团菌可能对选择性成分较敏感，因此应根据标准方法和样品特点合理使用。

十、贮存、废物处理与注意事项

本品不得用于临床检验。干粉培养基使用后应立即密封，置于避光、干燥处保存，避免吸潮、结块和性能下降。称量时应注意粉尘防护，建议佩戴口罩并在通风良好的环境中操作。未开封产品在规定条件下保质期为三年；开封后受储存湿度、温度和使用频次影响，保质时间可能缩短。

配制后的含添加剂平板应按实验室验证条件保存，并尽量在规定期限内使用。若平板出现明显干裂、污染、pH异常、添加剂漏加或质控结果不符合要求，应停止使用并排查原因。检测后的带菌培养物、平板和接触样品的耗材，应置于121 ℃高压灭菌30 min后，再按实验室生物安全要求处理。

参考标准与资料

GB/T 40392-2021《循环冷却水中军团菌的检测》。

WS 394-2012《公共场所集中空调通风系统卫生规范》（历史参考文件，已废止）。

相关水质和公共场所卫生检测方法中军团菌分离培养要求。