副溶血性弧菌的定性与定量检测：从增菌、分离到生化确认

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是常见的食源性致病菌之一，主要存在于海水、海产品及其加工环境中。该菌具有嗜盐性，常见于鱼、虾、贝类等水产品及其交叉污染样品。食品中副溶血性弧菌的检验通常包括定性检测和定量检测两类：定性检测用于判断样品中是否存在该菌，定量检测则用于估算样品中的污染水平。

GB 4789.7-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》规定了食品中副溶血性弧菌的检验方法。该方法的核心思路是：利用副溶血性弧菌耐盐、嗜碱、氧化酶阳性及在选择性培养基上的典型菌落特征，先进行增菌或定量稀释培养，再分离可疑菌落，最后通过纯培养、氧化酶试验、革兰氏染色、3%氯化钠三糖铁琼脂反应、嗜盐性试验及生化鉴定进行确认。

一、定性检测：判断样品中是否存在目标菌

定性检测通常以1:10样品匀液为起点，将制备好的样品匀液于36 ℃±1 ℃培养8 h～18 h。增菌培养的目的是让样品中可能存在的副溶血性弧菌恢复并增殖，提高后续分离检出的概率。

副溶血性弧菌对盐分有一定需求，因此增菌培养基通常采用含3%氯化钠的碱性蛋白胨水。碱性环境和适当盐浓度有利于弧菌生长，同时可在一定程度上抑制部分背景菌。定性检测的结果最终不是看增菌液是否混浊，而是要经过分离培养和后续确认后，才能报告是否检出副溶血性弧菌。

需要注意，增菌液出现生长并不等于副溶血性弧菌阳性，因为其他耐盐或嗜碱菌也可能生长。必须通过选择性平板和鉴定试验确认。

二、定量检测：采用MPN思路估算污染水平

定量检测通常采用多管发酵或MPN思路。先用无菌吸管吸取1 mL 1:10样品匀液，加入含9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管中，振摇混匀，制成1:100样品匀液。随后按同样方法依次进行10倍系列稀释。每递增稀释一次，都应更换一支无菌吸管或吸头，防止高浓度样液带入低浓度稀释液造成误差。

根据样品污染情况，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1 mL，于36 ℃±1 ℃培养8 h～18 h。培养后，对所有显示生长的增菌液进行分离培养和确认，并根据阳性管数组合查MPN表或按标准要求计算结果。

定量检测的关键是选择合适稀释度。如果样品污染较轻，稀释度过高可能全部阴性；如果污染严重，稀释度过低可能全部阳性，都会影响MPN结果的准确性。

三、分离培养：TCBS和弧菌显色培养基的作用

对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下约1 cm处沾取一环增菌液，划线接种于TCBS平板或弧菌显色培养基平板。一支试管对应划线一块平板，避免不同试管之间交叉污染。平板于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h后观察菌落形态。

副溶血性弧菌在TCBS平板上通常形成圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，直径约2 mm～3 mm。用接种环轻触时，常有类似口香糖样的黏弹质感。TCBS平板从培养箱取出后，应尽快挑取或标记可疑菌落，通常不宜超过1 h，以免菌落颜色和形态发生变化影响判断。

TCBS上的绿色菌落提示副溶血性弧菌可疑，但不能直接作为最终确认依据。部分其他弧菌或背景菌也可能形成类似菌落，因此必须继续纯培养和鉴定。

四、纯培养：获得单一菌株是后续鉴定前提

从选择性平板上挑取3个或以上可疑菌落，分别划线接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，获得纯培养物。挑取多个可疑菌落的目的是降低漏检风险，因为同一平板上不同可疑菌落可能并非同一种菌，典型和非典型菌落也可能同时存在。

纯培养物应形态一致、无杂菌污染。若纯化不充分，后续氧化酶、生化反应和嗜盐性试验可能出现混合反应，导致误判。

五、氧化酶试验与涂片镜检

副溶血性弧菌通常氧化酶阳性。试验时应挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，避免使用含糖较高或会干扰反应的培养基上的陈旧菌落。氧化酶阳性是弧菌鉴定的重要参考，但并不能单独确认副溶血性弧菌。

涂片镜检时，将可疑菌落进行革兰氏染色。副溶血性弧菌为革兰氏阴性菌，形态可呈杆状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。镜检可用于排除革兰氏阳性菌、芽胞杆菌或明显不符合弧菌形态的菌株。

六、3%氯化钠三糖铁琼脂反应

挑取纯培养的单个可疑菌落，转种至3%氯化钠三糖铁琼脂斜面，并穿刺底层，于36 ℃±1 ℃培养24 h后观察结果。副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的典型反应为：底层变黄但不变黑，无气泡；斜面颜色不变或红色加深；可见动力表现。

3%氯化钠三糖铁琼脂与普通TSI不同，加入氯化钠是为了满足副溶血性弧菌的嗜盐性。若盐浓度不合适，可能影响生长和反应判读。

七、嗜盐性试验：副溶血性弧菌鉴定的关键特征

副溶血性弧菌具有典型嗜盐特征。试验时，挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，于36 ℃±1 ℃培养24 h，观察液体是否混浊。

典型副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠胰胨水中不生长或微弱生长，在6%和8%氯化钠胰胨水中生长旺盛。该特征有助于与其他非嗜盐菌或耐盐性不同的弧菌区分。

嗜盐性试验应使用新鲜纯培养物，接种量和培养时间应一致。若结果边界不清，应结合其他生化试验和鉴定系统综合判断。

八、确定鉴定：多项生化反应综合判断

确定鉴定阶段，可取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基等，于36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h后观察结果。也可取3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。实验室还可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行确认。

副溶血性弧菌的最终确认应基于多个试验结果，而不是某一个单独反应。尤其在样品背景菌复杂、可疑菌落不典型或生化结果矛盾时，应重复纯化或采用更可靠的鉴定系统复核。

九、定性与定量检测的区别

定性检测更关注“有没有”，定量检测更关注“有多少”。但两者后续都需要通过分离培养和鉴定确认可疑菌株。若只看增菌液或选择性平板菌落形态，均不能作为最终结果。

十、常见问题与控制建议

十一、培养基质量控制要点

副溶血性弧菌检验对培养基盐浓度和选择性要求较高。3%氯化钠碱性蛋白胨水应能促进目标菌增殖；TCBS平板应具有良好的选择性和鉴别性；3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂应支持可疑菌纯培养；3%氯化钠三糖铁琼脂和不同盐浓度胰胨水应能稳定呈现生化与嗜盐性特征。

对于培养基生产和使用实验室而言，盐浓度、pH、选择性抑制剂和显色体系稳定性，是副溶血性弧菌检验培养基质量控制的关键。任何一个环节偏差，都可能导致漏检、误判或生化反应异常。

小结

副溶血性弧菌的定性检测用于判断食品中是否检出目标菌，定量检测则通过系列稀释和多管增菌估算污染水平。两类检测均需经过增菌、TCBS或弧菌显色培养基分离、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂纯培养，以及氧化酶试验、革兰氏染色、3%氯化钠三糖铁琼脂反应、嗜盐性试验和生化鉴定等步骤。

副溶血性弧菌检验的关键在于“盐浓度”和“确认流程”。增菌、纯培养和生化鉴定均应满足其嗜盐特性；选择性平板上的绿色菌落只能作为可疑结果，不能直接报告阳性。实际检验应以GB 4789.7-2013等现行有效标准为准，并做好培养基、试剂和质控菌株的质量控制。