生产商及实验室自制培养基和试剂的质量控制测试方法：GB 4789.28-2013流程解读

培养基和试剂是食品微生物检验的基础。对于生产商和实验室自制培养基而言，质量控制不能只停留在外观、pH和无菌性检查，还必须验证培养基是否真正具备预期功能：目标菌能否正常生长，非目标菌是否被有效抑制，鉴别反应是否典型，液体培养基是否能支持增菌或保持菌体存活，药敏相关培养基是否能给出稳定结果。

GB 4789.28-2013曾对生产商及实验室自制培养基和试剂的质量控制测试方法作出规定，内容包括非选择性固体培养基、选择性固体培养基、非选择性增菌培养基、选择性增菌培养基、选择性液体计数培养基、悬浮和运输培养基、Mueller-Hinton血琼脂、鉴定培养基以及实验试剂等。该标准现已被GB 4789.28-2024代替，实际检验应以现行有效标准为准。本文主要对旧版方法进行归纳解读，帮助理解培养基质量控制的基本逻辑。

一、质量控制的核心：促生长、选择性和鉴别性

培养基质量控制的本质，是用规定的质控菌株验证培养基是否符合用途。非选择性培养基重点看目标菌是否长得好；选择性培养基既要看目标菌能否生长，也要看非目标菌是否被抑制；鉴定培养基则要看反应是否清晰、典型、可重复。

因此，培养基质控不是“做一个阳性菌能长出来”就结束，而是要围绕培养基用途进行完整评价。

二、平板制备与保存：厚度、添加剂和干燥都很关键

固体培养基制备时，应将融化后的培养基倾注到平皿中，形成至少3 mm厚的琼脂层。直径90 mm平皿通常加入18 mL～20 mL琼脂培养基。若培养基需要加入血液、卵黄、抗生素、选择性添加剂或其他热敏试剂，应先将基础培养基冷却至47 ℃～50 ℃后再加入，并充分混匀。

平板倾注后应放置在水平表面，使琼脂自然冷却凝固。凝固后的培养基可立即使用，也可避光并置于2 ℃～8 ℃冰箱密封保存，在规定有效期内使用。使用前应对琼脂表面适当干燥，但不能过度干燥。

平板过薄、过湿或过干，都会影响菌落大小、扩散、计数结果和生长率评价。

三、非选择性固体培养基：用生长率PR评价促生长能力

非选择性分离和计数固体培养基的目标菌生长率通常采用定量测试方法。先将标准储备菌株接种至非选择性肉汤中过夜培养，或采用其他方法制备10倍系列稀释菌悬液。生长率测试常用接种水平为每平板20 CFU～200 CFU。

选择合适稀释度的工作菌悬液0.1 mL，均匀涂布接种于待测平板和参比平板，每个稀释度接种两个平板，也可采用螺旋平板法或倾注法。培养后选择菌落数适中的平板计数，计算生长率PR。

计算公式为：PR = Nₛ / N₀。

参比培养基的选择应符合目标微生物的生长需求。一般细菌可采用胰酪大豆胨琼脂，一般霉菌和酵母可采用沙氏葡萄糖琼脂；对营养有特殊要求的微生物，应采用适合其生长、且不含抑菌剂或抗生素的培养基作为参比培养基。

PR值越接近1，说明待测培养基对目标菌的支持能力越接近参比培养基。若PR明显偏低，应排查培养基营养、pH、灭菌、添加剂和保存条件。

四、选择性固体培养基：既要看目标菌，也要看非目标菌

选择性分离和计数固体培养基的质量控制包括两部分：目标菌生长率测试和非目标菌选择性测试。目标菌生长率测试方法与非选择性固体培养基类似，仍按PR = Nₛ / N₀计算。

选择性分离培养基允许一定程度抑制目标菌，因为其主要任务是从复杂背景中筛选目标菌；但选择性计数培养基用于定量，目标菌回收率要求更高，因此PR要求通常更严格。

五、非目标菌选择性半定量测试：用生长指数G判断抑制能力

选择性培养基还必须测试非目标菌是否被抑制。操作时，将标准储备菌株接种到非选择性肉汤中过夜培养作为工作菌悬液。用1 μL接种环取一环非目标菌工作菌悬液，在待测培养基表面划六条平行直线，同时接种两个平板，按规定培养条件培养。

操作时应使用接种环而不是接种针。接种环应完全浸入培养液中，取一满环接种物后，可轻触容器边缘3次去除多余液体。划线时，接种环与琼脂平面角度保持20°～30°，压力和速度应一致，整个过程应快速连续。

非目标菌的生长指数G一般应≤1，至少应达到<5。G值越低，说明培养基对非目标菌的抑制效果越好。若非目标菌大量生长，应考虑选择剂浓度不足、添加剂失效、培养基配制错误或保存不当。

六、非目标菌特异性测试：看菌落外观是否符合预期

部分培养基还需进行非目标菌特异性定性测试。该测试不是单纯观察是否抑制，而是观察非目标菌在培养基上是否呈现预期的菌落外观、大小和形态。操作时可用1 μL接种环取测试菌培养物，在培养基表面划平行直线，培养后观察结果。

这种测试常用于判断培养基鉴别性是否可靠。例如，非目标菌可能被允许生长，但应表现出与目标菌不同的菌落颜色、大小、沉淀、透明圈或其他形态特征，从而避免误判。

七、非选择性增菌培养基：低水平目标菌应能明显增殖

非选择性增菌培养基主要评价其促生长能力。培养基通常分装试管，每管10 mL。将标准储备菌株培养后制备系列稀释菌悬液，在待测培养基中接种10 CFU～100 CFU目标菌，每管接种量为1 mL，并设置两个平行管。

同时，将同一稀释度菌悬液1 mL倾注平板，接种两个平板，用于确认实际接种量。待测培养基按规定温度和时间培养后，用目测浊度值评价。

目标菌的浊度值应为2，说明培养基能支持低水平目标菌增殖。若增菌时间短于8 h，通常还需取一定量增菌液转接适合培养基，再按规定条件培养和计数，以确认增菌效果。

八、选择性增菌培养基：用混合菌测试富集能力

选择性增菌培养基既要验证目标菌能否在低接种量下增殖，也要验证非目标菌能否被抑制。旧版方法中，混合菌测试通常在待测培养基中接种10 CFU～100 CFU目标菌，同时接种1000 CFU～5000 CFU非目标菌，接种总量为1 mL，并设置两个平行管。

培养后，用10 μL接种环取一环混合菌培养液，划线接种到特定选择性平板上；同时对非目标菌培养液进行非选择性平板计数，评价其是否被抑制。

这种设计模拟了真实样品中“目标菌少、背景菌多”的情况，比单独接种目标菌更能反映选择性增菌培养基的实际性能。

九、选择性液体计数培养基：浊度与产气都要看

选择性液体计数培养基常用于MPN或多管法检测。测试时，目标菌通常接种10 CFU～100 CFU，非目标菌接种1000 CFU～5000 CFU，接种总量为1 mL，并设置平行管，同时通过平板计数确认接种量。

培养后用浊度值0～2评价生长情况，并记录小导管内气体体积比例。目标菌应出现明显混浊，浊度值为2，且产气应达到小导管体积的1/3或以上；非目标菌浊度值应为0或1，且无产气现象。

对于产气类培养基，仅观察混浊是不够的。目标菌是否产生典型气体反应，是评价培养基鉴别能力的重要指标。

十、悬浮培养基和运输培养基：重点看菌数是否稳定

悬浮培养基和运输培养基的功能不是增菌，而是在一定时间内保持目标菌存活，避免菌数显著下降或过度增殖。培养基通常每管分装10 mL，有特殊要求时可选用5 mL。

测试时，在待测培养基中接种100 CFU～1000 CFU目标菌，混匀后立即取1 mL倾注平板计数。剩余已接种菌液置20 ℃～25 ℃放置45 min后，再取1 mL倾注平板计数。若待测培养基有特殊保存要求，应按相应要求放置后再计数。

如果放置后菌数明显下降，说明培养基可能对目标菌有损伤；如果菌数明显升高，说明培养基可能不适合用作运输或悬浮介质，因为它促进了目标菌增殖，改变了样品原始状态。

十一、Mueller-Hinton血琼脂：用纸片扩散法验证药敏相关性能

Mueller-Hinton血琼脂用于苛养菌相关药敏试验时，平板厚度应为4 mm～5 mm。平板可立即使用，或避光并置于5 ℃±3 ℃冰箱密封保存，在有效期内使用。使用前可将平板置于35 ℃温箱或室温层流橱中适当干燥，培养基表面应湿润，但不能有水滴，培养皿也不应有水滴。

质控菌株应先在血平板上复苏培养，检查纯度合格后，用于制备质控菌悬液。将纯培养物悬浮于TSB肉汤中，调整至0.5麦氏标准，约为1×10⁸ CFU/mL～2×10⁸ CFU/mL。随后用涂布法接种MH平板，并贴相应抗生素纸片，每个平板最多贴6片。调整菌悬液浊度与完成全部接种之间的时间间隔不应超过15 min。

药敏相关培养基对厚度、pH、离子浓度、血液质量和表面水分非常敏感。任何偏差都可能影响抑菌圈大小。

十二、鉴定培养基：不同形态培养基有不同测试方式

鉴定培养基包括液体、半固体、高层斜面、普通斜面和平板等不同形式。其质控重点是阳性菌和阴性菌是否产生正确反应，且反应应清晰、稳定、可重复。

液体鉴定培养基可用约5麦氏浊度的菌悬液接种。需加指示剂的试验，应在微生物生长良好的情况下，按规定顺序加入指示剂后再观察结果。若菌株生长不良，鉴定反应无意义，应先排查培养基促生长能力或接种菌状态。

十三、实验试剂：按说明书验证阳性和阴性反应

实验试剂包括染色液、氧化酶试剂、触酶试剂、凝固酶试剂、吲哚试剂、血清学试剂等。测试方法通常按试剂说明书进行，并结合规定的阳性和阴性质控菌株判读。

试剂过期、保存不当或反复冻融，都可能造成假阴性或假阳性。因此，实验试剂也应纳入质量控制体系，而不是只在出现异常结果时才检查。

十四、质量控制记录与偏差处理

生产商和实验室自制培养基的质控记录应完整、可追溯。记录内容应包括培养基名称、配方或批号、制备日期、灭菌条件、pH、保存条件、测试菌株、接种量、培养条件、结果计算、判定结论和操作人员。

若出现PR偏低、G值偏高、目标菌不典型、非目标菌未被抑制、液体培养基不产气、运输培养基菌数变化过大等情况，应暂停使用该批培养基，进行偏差调查。

小结

生产商及实验室自制培养基和试剂的质量控制，应根据培养基用途选择合适测试方法。非选择性固体培养基重点评价目标菌生长率，PR应满足要求；选择性固体培养基既要测试目标菌PR，也要测试非目标菌G值；非选择性增菌培养基要求低水平目标菌能明显增殖；选择性增菌培养基要求目标菌在混合菌中能被富集，非目标菌被抑制；选择性液体计数培养基还需观察产气等典型反应；悬浮和运输培养基则要求菌数变化控制在规定范围内。

培养基质控的目标，是证明培养基在实际使用条件下具备稳定的促生长能力、选择性、鉴别性和保存性能。GB 4789.28-2013中的测试方法对理解培养基质量评价体系具有参考价值，但实际检验应以GB 4789.28-2024等现行有效标准和最新勘误文本为准。