副溶血性弧菌检验的样品制备：GB 4789.7—2013 方法要点解析

副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，常见于海产品、水产品及其加工环境中。GB 4789.7—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》中，样品制备是整个检验流程的第一步，也是影响后续增菌、分离和鉴定结果的关键环节。样品保存温度、解冻方式、取样部位、稀释液种类和均质程度，都会影响副溶血性弧菌的回收率。

与普通食品微生物样品制备不同，副溶血性弧菌检验不能直接使用普通无菌生理盐水或一般蛋白胨水作为初始稀释液，而应使用3%氯化钠碱性蛋白胨水。这是因为副溶血性弧菌具有嗜盐性，适当盐浓度和偏碱性环境有利于其恢复和增殖，同时可在一定程度上抑制部分非目标菌。

一、样品保存与解冻

非冷冻样品采集后，应立即置于7℃～10℃条件下保存，并尽可能及早检验。这里的低温保存不是为了长期贮藏，而是为了降低样品中微生物数量继续变化的速度，减少目标菌增殖、死亡或被背景菌竞争影响。样品若长时间在常温下放置，可能导致菌群结构变化，影响检验结果的代表性。

冷冻样品需要解冻后再制备样品匀液。GB 4789.7—2013规定，冷冻样品可在45℃以下不超过15 min解冻，或在2℃～5℃条件下不超过18 h解冻。两种方式的目的都是在尽量恢复样品可处理状态的同时，减少微生物数量变化。高温长时间解冻不可取，因为可能造成目标菌损伤或背景菌快速变化；低温解冻时间过长，也可能影响样品状态和检测时效。

二、不同水产品的取样部位

副溶血性弧菌在水产品中的分布并不均匀，因此取样部位应符合标准要求。鱼类和头足类动物可取表面组织、肠或鳃；贝类应取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类可取整个动物，或取动物中心部分，包括肠和鳃。

对于带壳贝类或甲壳类，标准要求先用自来水洗刷外壳并甩干表面水分，再以无菌操作打开外壳，按要求取相应部分。这个步骤容易被误解。清洗外壳的目的不是对样品“消毒”，而是减少泥沙、附着物和外表面污染物对开壳取样的干扰。清洗后必须甩干或沥干表面水分，避免外壳水分进入样品，造成稀释或带入外部污染。

三、为什么使用3%氯化钠碱性蛋白胨水

样品制备时，取25 g或25 mL样品，加入225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，制成1:10样品匀液。这个比例是食品微生物检验中常见的初始稀释方式，但副溶血性弧菌检验的特殊之处在于稀释液含有3%氯化钠并呈碱性。

3%氯化钠满足副溶血性弧菌对盐分的需求，有利于其在后续增菌阶段恢复生长；蛋白胨提供基础氮源和营养；偏碱性环境有利于弧菌增殖，并可抑制部分不耐碱的背景菌。若错误使用普通缓冲蛋白胨水或无盐稀释液，可能导致副溶血性弧菌恢复不足，降低检出率。

四、均质方法与操作要求

标准推荐两种机械均质方式：使用旋转刀片式均质器时，以8000 r/min均质1 min；使用拍击式均质器时，拍击2 min。机械均质的目的，是将样品中的微生物尽可能释放到3%氯化钠碱性蛋白胨水中，并使样品匀液均一。如果均质不足，目标菌可能仍附着在组织、鳃、肠内容物或贝肉碎块上，导致后续增菌代表性不足。

均质时应注意无菌操作。均质袋、均质杯、刀头、剪刀、镊子、称量工具和容器均应无菌或经适当灭菌处理。对于含壳、含骨、含硬组织或含大量脂肪的样品，应避免硬质碎片损坏均质袋或影响均质器运行。均质后样品匀液应尽快进入后续增菌或定量操作，不宜长时间放置。

五、无均质器时的手工制备方法

如果实验室没有均质器，可按标准采用无菌乳钵研磨法。操作时，将样品放入无菌乳钵，从225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量加入乳钵，使样品充分磨碎；然后将磨碎样品转入500 mL无菌锥形瓶。再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，冲洗液一并转入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部加入锥形瓶中，充分振荡，制备成1:10样品匀液。

这个步骤中的“冲洗乳钵残留”非常重要。若研磨后的残留样品未被冲洗转移，会造成实际检样量不足，影响检测结果。尤其是贝肉、肠内容物和组织碎块容易黏附在乳钵壁上，必须用原定量稀释液冲洗并合并，才能保证25 g样品与225 mL稀释液的比例准确。

六、样品制备中的常见错误

样品保存温度不符合要求，是常见问题之一。非冷冻样品长时间常温运输，可能导致副溶血性弧菌数量变化；冷冻样品在高温下长时间解冻，也可能造成菌体损伤或样品微生物状态改变。

取样部位不正确也会影响检出。对于贝类，如果只取贝肉而丢弃体液，可能低估污染；对于鱼类或甲壳类，如果完全避开鳃、肠等高风险部位，也可能降低检出概率。

稀释液使用错误同样严重。副溶血性弧菌检验应使用3%氯化钠碱性蛋白胨水制备样品匀液，而不是普通无菌水、生理盐水或普通缓冲蛋白胨水。无盐或低盐环境可能不利于副溶血性弧菌恢复，影响后续增菌效果。

均质不足会造成样品不均一，使后续取液不具代表性。相反，过度剧烈处理也可能使样品产生大量泡沫、气溶胶或组织碎屑，增加污染风险和操作误差。因此，均质时间和转速应按标准控制。

七、样品匀液与后续检验的衔接

制备好的1:10样品匀液既是后续定性增菌的起点，也是定量检验中系列稀释和多管接种的基础。样品匀液应充分混匀后再取液，避免组织沉降或脂肪上浮造成取样不均。若样品中含有大量脂肪、碎屑或悬浮物，可在不影响目标菌回收的前提下，按实验室SOP选择适宜取液部位，但不能随意过滤或弃去可能含菌的部分。

样品制备后应尽快进行后续培养。副溶血性弧菌检验依赖后续3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌、TCBS琼脂或弧菌显色培养基分离、纯化和生化鉴定。样品制备环节一旦出现偏差，后续即使培养基和鉴定步骤正确，也难以弥补前处理带来的误差。

八、总结

GB 4789.7—2013中副溶血性弧菌样品制备的核心要求可以概括为：正确保存、规范解冻、按样品类型选择代表性部位、使用3%氯化钠碱性蛋白胨水，并充分均质制备1:10样品匀液。鱼类、头足类、贝类和甲壳类样品的取样部位不同，带壳样品还需要先清洁外壳并去除表面水分后再无菌开壳。

样品制备看似只是前处理步骤，但它直接决定副溶血性弧菌能否被有效释放、恢复和增菌。对食品微生物实验室而言，规范样品制备是保证副溶血性弧菌检验结果准确、可靠和可追溯的基础。