粪肠球菌检验标准操作程序解析：KF链球菌琼脂计数、鉴定与结果报告

粪肠球菌，学名 Enterococcus faecalis，属于肠球菌属，是一类革兰氏阳性球菌。它广泛存在于人和动物肠道、环境及部分发酵或生物制品中。在功能性微生物产品中，粪肠球菌可能作为目标功能菌进行质量控制；在其他场景中，它也可能作为肠源性污染或卫生状况评价的参考对象。因此，粪肠球菌检验不仅要观察平板上是否有可疑菌落，还要通过形态学和生化鉴定确认其菌种身份。

依据 GB/T 34224—2017《生物产品中功能性微生物检测》，粪肠球菌检验通常采用“样品制备—系列稀释—KF链球菌琼脂平板涂布培养—特征菌落计数—肠球菌肉汤纯培养—革兰染色镜检—生化鉴定—结果计算与报告”的流程。该方法的关键在于：选择性平板只用于初筛，最终结果必须经鉴定确认后再计算和报告。

一、检测思路与方法原理

粪肠球菌检验可用于定性和定量两类目的。定性报告用于说明 25 g 或 25 mL 样品中是否检出粪肠球菌；定量报告则用于评价样品中粪肠球菌数量，结果通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。

KF链球菌琼脂培养基可对肠球菌形成一定选择性，并使目标菌形成暗红色至粉红色、表面光滑、周边整齐的典型菌落。但需要注意，肠球菌属内不同菌种形态相近，部分非目标菌也可能形成相似菌落。因此，本方法采用“特征菌落计数 + 挑取鉴定 + 按确认比例换算”的方式，避免把所有相似菌落都直接计为粪肠球菌。

二、主要设备与材料

除微生物实验室常规灭菌和培养设备外，粪肠球菌检验还需要恒温培养箱或恒温厌氧培养箱、冰箱、天平、均质器、无菌均质袋或均质杯、振荡器、无菌吸管或移液器、无菌锥形瓶、无菌培养皿、显微镜以及 pH 检测工具。

肠球菌为兼性厌氧菌，在普通培养和厌氧条件下均可生长。原方法中采用 37℃±1℃厌氧培养 48h±2h，应按标准或实验室受控 SOP 执行；若实验室改用普通培养条件，应进行方法适用性确认，确保目标菌生长和选择性符合要求。

三、培养基和试剂的作用

粪肠球菌检验常用 KF链球菌琼脂培养基、肠球菌肉汤、无菌生理盐水、革兰氏染色液和细菌生化鉴定试剂盒。

KF链球菌琼脂平板上的颜色和形态只能作为“可疑菌落”判断依据。粪肠球菌与屎肠球菌、其他肠球菌及部分链球菌在显微形态上相似，必须结合生化鉴定结果进行最终判定。

四、样品制备：获得均匀的 1:10 样品匀液

固体和半固体样品取 25 g，加入含 225 mL 无菌生理盐水 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 样品匀液；也可置于含 225 mL 无菌生理盐水的无菌均质杯中，以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min。

液体样品应先充分摇匀，再用无菌吸管吸取 25 mL，加入装有 225 mL 无菌生理盐水 的无菌锥形瓶中。锥形瓶内可预置适量无菌玻璃珠，充分振摇后制成 1:10 样品匀液。

样品制备必须充分均匀。功能性微生物产品常含有载体、粉末、颗粒、蛋白原料或保护剂，菌体可能分布不均或吸附在颗粒表面。若均质不充分，会导致平行平板差异较大，影响计数准确性。

五、样品稀释：每次递增稀释都要更换吸管

用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 无菌生理盐水 的无菌试管中。操作时吸管尖端不要触及稀释液面，随后振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打混匀，制成 1:100 样品匀液。

继续进行 10 倍递增稀释时，每递增一次稀释，都应更换新的无菌吸管或吸头，以避免高浓度样品带入低浓度稀释液，造成计数偏高。稀释度应根据样品中目标菌预估含量设置，通常选择 2～3 个连续适宜稀释度用于接种。

六、平板接种与培养

根据待检样品菌含量估计，选择 2～3 个连续适宜稀释度。每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液，接种于 KF链球菌琼脂平板表面，用无菌涂布棒小心、快速、均匀地涂布于琼脂表面。涂布棒不得接触平皿边缘。每个稀释度接种 2 个平板。

涂布后，将平板静置约 10 min，使接种物完全被培养基吸收。随后翻转平皿，置 37℃±1℃厌氧培养箱中培养 48h±2h。

平板涂布时应控制接种液吸收状态。若平板表面过湿，菌液易流动，导致菌落融合或分布不均；若平板过干，则可能影响目标菌恢复和典型菌落形成。培养完成前不宜频繁移动或开关培养箱，以减少温度波动。

七、特征菌落计数

培养结束后，选择特征菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、且无蔓延菌落生长的平板进行计数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数；大于 300 CFU 的平板可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若其中一个平板出现较大片状菌落，该平板不宜采用，可用同一稀释度中无片状菌落生长的平板作为该稀释度菌落数。若片状菌落不到平板面积的一半，而其余一半菌落分布均匀，可计算半个平板后乘以 2，代表该平板菌落数，但应在原始记录中注明。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，可将每条单链作为一个菌落计数。粪肠球菌在 KF链球菌琼脂平板上的可疑特征菌落通常为 暗红色至粉红色、表面光滑、周边整齐。这些特征用于挑选可疑菌落，但不能作为最终确认依据。

八、菌落挑选、纯培养与鉴定

1. 菌落挑选和纯培养

从平板上挑选 5 个暗红色至粉红色、表面光滑、周边整齐的可疑菌落，分别转入肠球菌肉汤培养基中，于 37℃±1℃培养 24h±2h，随后进行形态学和生化鉴定。

挑取多个菌落可以提高结果代表性。若平板上菌落形态不完全一致，应挑取不同类型的可疑菌落分别确认，避免只挑选最典型菌落而漏计部分目标菌，或把相似非目标菌误计入结果。

2. 形态学鉴定

取纯培养物进行革兰氏染色并镜检。粪肠球菌应为 革兰氏阳性球菌，呈球形或椭圆形，直径约 0.5 μm～1.0 μm，常成对或短链状排列，无芽胞。

若镜检显示革兰氏阴性菌、杆菌、芽胞菌或明显混合菌形态，说明该菌落不符合粪肠球菌基本特征，或纯培养不充分，应重新分离纯化后再鉴定。

3. 生化鉴定

使用细菌生化鉴定试剂盒进行菌种确认。肠球菌属内常见菌种形态相似，例如粪肠球菌和屎肠球菌仅靠显微镜难以区分，因此必须通过生化鉴定或其他可靠鉴定方法确认。

若菌株形态学特征和生化鉴定结果均符合粪肠球菌，可判定为粪肠球菌。若结果不一致，应重新纯化后复测，必要时采用质谱或分子生物学方法进一步确认。

九、目标菌数量如何计算？

由于平板上的特征菌落不一定全部为粪肠球菌，需要根据挑取鉴定结果计算每块平板中的目标菌数量。计算公式为：

a = b / A × C

其中，a 为每块平板上的粪肠球菌菌落数；b 为挑取后经证实为粪肠球菌的菌落数；A 为挑取平板上用于验证的菌落数；C 为平板上的所有特征菌落数。

例如，某平板上共有 100 个特征菌落，挑取 5 个进行鉴定，其中 4 个确认为粪肠球菌，则该平板目标菌菌落数为：

a = 4 / 5 × 100 = 80 CFU

若只有一个稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板中粪肠球菌菌落数的平均值，再根据稀释倍数和接种体积换算为每克或每毫升样品中的菌落总数。

若两个连续稀释度平板菌落数均在适宜计数范围内，应按加权公式计算：

N = ΣC / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；ΣC 为纳入计算平板的粪肠球菌菌落数之和；n₁ 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n₂ 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度稀释因子。

需要特别注意，本方法每皿涂布量为 0.1 mL。如果公式中的 d 未包含接种体积校正，实验室在换算 CFU/g 或 CFU/mL 时应明确乘以相应体积校正系数，避免低估结果。

十、结果判定与报告

若样品菌落符合粪肠球菌形态学及生化鉴定特征，可判定为粪肠球菌。

定性报告可写为：25 g 或 25 mL 样品中检出粪肠球菌，或 25 g 或 25 mL 样品中未检出粪肠球菌。

定量报告时，菌落数小于 100 CFU 时，以整数报告；菌落数大于或等于 100 CFU 时，对第 3 位数字进行修约后保留前 2 位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，采用两位有效数字。例如 12600 CFU/g 可报告为 1.3×10⁴ CFU/g。

十一、常见问题与注意事项

第一，KF链球菌琼脂上的暗红色或粉红色菌落只是可疑菌落，不能直接报告为粪肠球菌，必须经形态学和生化鉴定确认。

第二，涂布量为 0.1 mL，结果换算时必须考虑接种体积。若只乘稀释倍数，可能造成结果低估。

第三，加权公式应写清楚括号和除号，推荐写作 N=ΣC/[(n₁+0.1n₂)×d]，避免因书写不清导致计算错误。

第四，肠球菌常成对或短链状排列，平板上如出现菌落间无明显界线的链状生长，应按方法规定将每条单链作为一个菌落计数。

第五，样品必须充分均质。粉末、颗粒、半固体或含载体样品若分散不充分，会造成结果平行性差。

第六，每次递增稀释应更换无菌吸管或吸头，避免交叉带菌。

第七，培养条件应按标准或实验室 SOP 执行。若将厌氧培养改为普通培养，应经过方法适用性确认。

第八，肠球菌属不同菌种形态相近，粪肠球菌和屎肠球菌不能仅靠镜检区分，必须依靠生化鉴定或其他可靠鉴定方法确认。

十二、小结

粪肠球菌检验是功能性微生物产品质量控制中的重要内容。该方法以无菌生理盐水制备样品匀液，经系列稀释后取 0.1 mL 涂布于 KF链球菌琼脂平板，在 37℃±1℃培养 48h±2h，选择 30 CFU～300 CFU 的特征菌落平板进行计数，并挑取可疑菌落进行肠球菌肉汤纯培养、革兰染色镜检和生化鉴定。

该方法的关键在于：样品制备充分、稀释准确、涂布均匀、培养条件符合要求、特征菌落经鉴定确认后再换算目标菌数量。对于功能性微生物检测而言，粪肠球菌结果不能只依赖平板颜色，而应结合菌落形态、显微形态和生化鉴定结果综合判断，才能保证检测结果准确可靠。