出口食品中产气荚膜梭菌计数方法解析：SC平板、确证试验与结果换算

产气荚膜梭菌，学名 Clostridium perfringens，旧资料中也常称为“产气荚膜梭状芽孢杆菌”。它是一类革兰氏阳性、厌氧、产芽孢杆菌，广泛存在于土壤、尘埃、动物肠道、肉类及其加工环境中。该菌能在厌氧条件下快速生长，部分菌株可产生肠毒素，引起食源性胃肠炎。肉制品、禽肉、调理食品、熟制后长时间保温或冷却不当的食品，是其风险控制重点。

出口食品中产气荚膜梭菌计数方法，主要用于测定食品样品中该菌的数量。该方法的核心思路是：样品经系列稀释后接种于 亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（SC），在厌氧条件下培养，计数黑色可疑菌落，再通过乳糖亚硫酸盐试验、动力-硝酸盐试验、乳糖-明胶液化试验或自动微生物鉴定系统进行确证，最后按确证阳性比例修正菌落数并报告 CFU/g 或 CFU/mL。

一、方法原理：为什么SC平板上菌落会变黑？

产气荚膜梭菌在特定选择性培养基上可还原亚硫酸盐生成硫化物，硫化物与铁盐反应形成黑色沉淀，使菌落呈黑色。因此，SC 琼脂上的黑色菌落是该方法筛选目标菌的重要特征。

但黑色菌落并不等于一定是产气荚膜梭菌。其他厌氧亚硫酸盐还原菌也可能在类似培养基上形成黑色菌落。因此，计数时必须挑取典型或可疑菌落进行确证。只有经确证符合产气荚膜梭菌特征的菌落，才能参与最终结果换算。

本方法中产气荚膜梭菌的确认特征包括：在 SC 琼脂上形成黑色菌落；乳糖亚硫酸盐培养基中产气并形成黑色沉淀；或表现为无动力、硝酸盐还原、乳糖产酸产气、48 h 内明胶液化等特征；也可通过全自动微生物鉴定系统确认。

二、主要设备与材料

该方法属于厌氧平板计数法，对培养温度、厌氧环境和培养时间要求较高。

厌氧环境是该方法的关键。若厌氧条件不足，产气荚膜梭菌可能生长受限，平板菌落偏少；同时部分背景菌可能干扰结果，造成计数偏差。

三、培养基和试剂的作用

SC 琼脂的选择性和显色能力直接影响初筛效果；LS、动力-硝酸盐和乳糖-明胶试验则用于确认黑色菌落是否真正符合产气荚膜梭菌特征。

四、样品稀释：制备1:10样品匀液

无菌操作称取 25 g 或 25 mL 样品，置无菌均质器或均质袋中，加入 225 mL 蛋白胨水，充分均质，制成 1:10 样品匀液。

吸取 1:10 样品匀液 1 mL，加入 9 mL 蛋白胨水中，混匀，制成 1:100 样品匀液。必要时继续进行 10 倍递增稀释。每次递增稀释都应更换新的无菌吸管或吸头，避免高浓度样品带入低浓度稀释液，造成计数偏高。

对于含脂肪、肉糜、调味料或颗粒较多的样品，应充分均质。样品不均匀会导致平行平板差异较大，影响计数结果。

五、SC平板接种与厌氧培养

选择 2～3 个适宜稀释度 的样品匀液。每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液，加入到两个无菌平皿内，即每个稀释度做两个平行平板。

向平皿中倾注 10 mL～15 mL 维持在 44℃～47℃ 的 SC 琼脂，轻轻转动平皿，使样液与培养基混合均匀。待培养基凝固后，再覆盖 10 mL SC 琼脂，完全凝固后翻转平板，置厌氧罐或其他适宜厌氧装置中，在 37℃±0.5℃厌氧培养20 h±2 h。

覆盖一层 SC 琼脂的目的，是降低氧扩散，形成更适合厌氧菌生长的环境，同时有助于黑色菌落显现。培养时间不宜过长，原方法中特别提醒：培养时间过长可能导致平板整体颜色过黑，影响菌落识别和计数。

六、平板计数：选择小于150 CFU的平板

培养结束后，选择菌落数 小于150 CFU 的平板，计数每个平板上的黑色菌落数，并记录对应稀释倍数。若黑色菌落过多、平板发黑严重或菌落融合，应选择更高稀释度平板计数。

每个平板挑取 5 个典型或可疑黑色菌落进行确证；若可疑菌落少于 5 个，则全部挑取。由于最终结果要按确证阳性比例修正，因此挑取菌落应具有代表性。若平板上存在不同形态的黑色菌落，应尽量覆盖不同类型，避免只挑取最典型菌落导致阳性比例偏高。

七、乳糖-亚硫酸盐试验确证

1. 接种

将 SC 琼脂上的典型或可疑黑色菌落接种到 液体硫乙醇酸盐培养基中，置 37℃±0.5℃厌氧培养18 h～24 h。随后用无菌吸管移取硫乙醇酸盐培养物 5滴，加入到 乳糖-亚硫酸盐（LS）培养基中，置 46℃水浴需氧条件下培养18 h～24 h。

2. 观察与判读

观察倒管内是否有气泡产生，以及试管底部是否变黑。若倒管中 四分之一以上充满气体，且有黑色沉淀物，可判定为 LS 阳性。

若倒管中气体不足四分之一，应立即从原 LS 培养基中吸取 5 滴，接种到另一支 LS 培养基试管中，于 46℃水浴培养 18 h～24 h 后再次观察。

在 SC 培养基上形成黑色菌落，同时 LS 培养基反应阳性的细菌，可确认为产气荚膜梭菌；不符合者应视为阴性。

LS 试验同时考察产气和亚硫酸盐还原能力，是该方法中较直接的确认步骤。判读时要注意倒管气体量和黑色沉淀两项都符合，不能只看其中一项。

八、动力-硝酸盐与乳糖-明胶试验确证

该确证路线通过多个典型生化特征综合确认产气荚膜梭菌。

1. 接种与培养

将挑取的纯菌落分别穿刺接种 缓冲动力-硝酸盐培养基 和 乳糖-明胶培养基，置 37℃±0.5℃厌氧培养24 h。

2. 动力-硝酸盐试验

在透射光下观察缓冲动力-硝酸盐培养基中细菌沿穿刺线的生长情况。有动力菌株会沿穿刺线向外扩散生长；无动力菌株通常仅沿穿刺线生长。产气荚膜梭菌通常为 无动力。

随后加入 0.5 mL 亚硝酸盐检测试剂甲和 0.2 mL 试剂乙。若出现橙红色，表明菌株将硝酸盐还原为亚硝酸盐。若 15 min 内未出现颜色变化，则加入少量锌粉，放置 10 min。若加锌粉后出现橙红色，说明菌株不能还原硝酸盐。

需要注意，产气荚膜梭菌硝酸盐还原反应通常较强而迅速。若仅出现微弱浅粉色，应谨慎判读，不宜直接作为典型阳性。

3. 乳糖-明胶试验

观察乳糖-明胶培养基是否产气、变黄，以及明胶是否液化。产气和培养基变黄色表示乳糖发酵产酸。将试管置 5℃冷却1 h 后检查明胶液化情况。若培养基仍为固态，可再置 37℃±0.5℃培养24 h，再次检查明胶是否液化。

在 SC 琼脂上形成黑色菌落，并表现为 无动力、通常硝酸盐还原阳性、乳糖产酸产气、48 h 内能液化明胶 的细菌，可确认为产气荚膜梭菌。

九、自动微生物鉴定系统确证

也可使用全自动微生物鉴定系统进行确证。操作时，将 SC 琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃±0.5℃厌氧培养18 h～24 h，再划线接种 SC 琼脂平板，并覆盖 10 mL SC 琼脂。待完全凝固后，37℃±0.5℃厌氧培养18 h～24 h，获得纯培养黑色菌落。

如使用 VITEK compact，可从 SC 平板上挑选可疑菌落，用生理盐水制成浊度适当的菌悬液，使用 VITEK compact 全自动微生物鉴定系统及 ANI 鉴定卡进行鉴定。若分离不充分，应重复纯化，直至获得典型、分离良好的黑色菌落。

自动鉴定可提高效率，但仍需注意菌株纯度、菌龄、接种浓度和数据库适用性。混合菌或非典型菌落可能导致鉴定结果不可靠。

十、结果判定与计算

任何符合 LS 试验确证、动力-硝酸盐及乳糖-明胶确证，或经自动微生物鉴定系统鉴定为产气荚膜梭菌的菌落，均可确认为产气荚膜梭菌。

样品中产气荚膜梭菌计数应基于被证实为产气荚膜梭菌菌落的比例进行修正。计算思路如下：

产气荚膜梭菌数 = 平板平均黑色菌落数 ×（确证阳性菌落数 / 挑取可疑菌落数）× 稀释倍数

例如，10⁻⁴ 稀释度平板平均有 85 个黑色菌落，从两个平板共挑取 10 个菌落进行确证，其中 8 个被证实为产气荚膜梭菌，则每克食品中产气荚膜梭菌数为：

85 ×（8 / 10）× 10000 = 680000 CFU/g

可报告为：

6.8×10⁵ CFU/g

若样品为液体，则按 CFU/mL 报告。报告时应根据实验室报告规则和有效数字要求进行修约。

十一、常见问题与注意事项

第一，SC 平板上的黑色菌落只是可疑菌落，不能直接全部计为产气荚膜梭菌。必须通过确证试验或自动鉴定进行修正。

第二，SC 琼脂温度应控制在 44℃～47℃再倾注。温度过高可能损伤目标菌，温度过低则不易混匀和倾注。

第三，覆盖层很重要。覆盖 SC 琼脂有助于形成低氧环境和清晰菌落，漏加覆盖层可能影响生长和显色。

第四，培养时间不宜过长。过度培养可能导致平板颜色整体变深甚至发黑，影响黑色菌落计数。

第五，厌氧环境必须有效。应使用合格厌氧装置和厌氧指示剂，培养期间避免频繁打开容器。

第六，LS 试验应同时观察气体和黑色沉淀。只有倒管气体量达到要求并出现黑色沉淀，才可判为阳性。

第七，动力-硝酸盐试验中，加锌粉后的判读非常关键。加锌后变红说明硝酸盐未被菌株还原，不能误判为阳性。

第八，乳糖-明胶试验需经冷却判断明胶液化。明胶在高温下本身呈液态，必须冷却后观察是否重新凝固。

第九，挑取确证菌落应具有代表性。如果平板上有多种黑色可疑菌落形态，应分别挑取确认。

第十，结果换算应乘以确证阳性比例。若忽略该比例，容易高估样品中产气荚膜梭菌数量。

十二、小结

出口食品中产气荚膜梭菌计数方法，是一种以 SC 琼脂厌氧倾注培养、黑色菌落计数和确证阳性比例修正为核心的定量方法。该方法先将样品制备为 1:10 匀液并进行系列稀释，再将适宜稀释度样液与 SC 琼脂混匀倾注并覆盖，37℃±0.5℃厌氧培养20 h±2 h 后计数黑色菌落。

由于黑色菌落并非全部都是产气荚膜梭菌，必须通过乳糖-亚硫酸盐试验、动力-硝酸盐和乳糖-明胶液化试验，或全自动微生物鉴定系统进行确证。最终结果应按确证阳性比例修正，并以 CFU/g 或 CFU/mL 报告。规范控制厌氧环境、培养时间、SC 平板质量和确证步骤，是保证该方法结果准确可靠的关键。