菌种保藏：如何让微生物“长期休眠”而不失活？

在微生物检测、科研实验、菌种资源管理以及发酵生产过程中，菌种是最基础也是最重要的生物资源之一。无论是药品微生物检验中使用的标准菌株，还是食品、环境、工业发酵领域使用的生产菌种，都需要通过科学的保藏技术维持其存活能力和生物学特性。如果菌种保存不当，轻则出现活力下降、污染杂菌，重则发生遗传变异、性状退化甚至完全失活，导致实验结果失真或生产失败。因此，菌种保藏不仅是一项基础实验技术，更是实验室质量管理体系中的重要组成部分。

从本质上讲，菌种保藏的目的并不是让微生物永久停止生命活动，而是通过降低其代谢水平，使其处于一种相对稳定的“休眠状态”，从而尽可能保持菌株的存活性、纯度、遗传稳定性以及典型生物学特征。当需要使用时，再通过适当的复苏培养恢复其正常生长能力。

由于不同微生物对温度、水分、氧气、营养条件以及外界环境变化的耐受能力存在明显差异，因此并不存在一种适用于所有菌种的保藏方法。例如，芽孢杆菌形成的芽孢具有极强的抗逆性，可以耐受长期干燥保存；而某些营养要求较高的细菌则对环境变化十分敏感，需要采用低温冷冻或冻干等方式保存。因此，在实际工作中，应根据菌种类型、保存期限、使用频率以及实验室设备条件选择合适的保藏方案。

为什么菌种会发生退化和变异？

很多实验人员在日常工作中会发现，同一株菌经过多次传代后，其菌落形态、生长速度、生化反应甚至药物敏感性都可能发生变化。这种现象被称为菌种退化或性状漂移。

造成这种情况的原因主要包括遗传变异、培养环境选择压力以及长期连续传代。微生物繁殖速度极快，在不断分裂过程中可能发生基因突变。当实验室长期采用传代培养保存菌种时，实际上是在不断进行人工筛选，一些原本具有代表性的性状可能逐渐丢失。因此，对于标准菌株、质控菌株以及重要生产菌种，通常不建议长期依赖传代保存，而应建立规范的长期保藏体系。

常见的菌种保藏方法

目前实验室常用的菌种保藏方法主要包括传代培养法、液体石蜡保藏法、载体保藏法、冷冻保藏法以及冷冻真空干燥法等。

传代培养法：最简单但并非最佳选择

传代培养法是最传统的菌种保存方式。实验人员将菌种接种于适宜培养基中培养生长，然后置于4℃冰箱保存，并定期重新转种。

这种方法最大的优点是操作简单、成本低、取用方便，因此广泛用于实验室日常工作菌株的短期保存。例如微生物检验实验室常将工作菌株保存在营养琼脂斜面、TSA斜面或沙保弱培养基斜面中。

然而，传代培养法最大的缺点也十分明显。随着传代次数增加，菌株发生污染、退化和遗传变异的风险不断提高。因此，该方法更适合作为短期保存手段，而不适合作为菌种资源的长期保存方式。

液体石蜡保藏法：经典的中期保存技术

液体石蜡保藏法是在已经长好菌的斜面培养基表面覆盖一层无菌液体石蜡，使菌体与空气隔绝，同时减少培养基水分蒸发。

这种方法曾经是许多实验室保存菌种的重要手段。对于多数细菌、酵母菌、放线菌以及部分霉菌而言，液体石蜡保藏能够显著延长保存时间。部分芽孢菌和放线菌甚至可以保存数年而保持较好的活力。

虽然现代实验室越来越多采用冷冻保存和冻干保存技术，但液体石蜡法因设备要求低、操作方便，至今仍具有一定应用价值。

载体保藏法：利用干燥环境延长寿命

载体保藏法是将微生物吸附于某种固体载体上，经干燥后进行保存。

常见载体包括砂土、土壤、硅胶、滤纸片、磁珠以及麸皮等。其中最经典的是砂土管保藏法。

砂土管保藏法尤其适用于芽孢杆菌、放线菌以及产生孢子的霉菌。由于这些微生物本身具有较强的抗干燥能力，因此在干燥砂土环境中能够长期保持活性。过去许多抗生素生产企业和菌种保藏机构都曾广泛采用这种方法。

需要注意的是，砂土保藏更适合孢子型微生物，对于不形成芽孢或孢子的营养细胞，其保存效果通常较差。

冷冻保藏法：现代实验室的主流选择

随着低温设备的普及，冷冻保藏已经成为目前最常见的菌种长期保存方式之一。

冷冻保存的核心原理是通过降低温度抑制微生物代谢活动，使细胞进入休眠状态。根据保存温度不同，可分为普通低温冷冻保存（如-20℃、-40℃、-80℃）以及液氮保存（约-196℃）。

其中，-80℃超低温冰箱保存是目前科研机构、药企和第三方检测实验室最常采用的方法。对于多数细菌、酵母菌和真菌而言，在适当保护剂存在的条件下，可稳定保存多年。

冷冻保存过程中通常需要加入甘油、二甲基亚砜（DMSO）、脱脂乳、蔗糖等冷冻保护剂，以减少冰晶形成对细胞造成的机械损伤。否则，细胞在冻结和解冻过程中容易发生破裂，导致复苏率下降。

冷冻真空干燥法：长期保藏的“黄金标准”

在众多菌种保藏技术中，冷冻真空干燥法（Lyophilization）被认为是最经典、最可靠的长期保存方法之一。

该方法首先将菌悬液进行低温冻结，然后在真空条件下使冰直接升华，从而去除水分。由于整个过程在低温下进行，因此能够最大程度保护细胞结构和生物活性。

经过冻干处理后的菌种通常被密封于安瓿瓶或冻干管中保存。在适宜条件下，许多菌株可以稳定保存十年以上，甚至数十年。

目前，国内外大型菌种保藏中心、标准菌株供应机构以及药典菌种库普遍采用冻干技术保存重要菌株。例如ATCC、CICC、CMCC等菌种资源机构均大量采用冷冻真空干燥技术进行长期保藏。

值得注意的是，并非所有微生物都适合直接冻干保存。不同菌种需要选择不同的冻干保护剂配方，以提高冻干后的存活率和复苏率。

菌种保藏中的关键控制点

无论采用哪种保藏方法，都应遵循几个基本原则。

首先，保藏前必须确认菌种来源可靠、纯度合格、编号准确，并建立完整档案。对于标准菌株和质控菌株，应保留完整的来源证明和传代记录。

其次，应选择生长状态良好的培养物进行保藏。一般来说，细菌宜选择对数生长期后期或稳定期早期培养物；芽孢菌应选择芽孢形成充分的培养物；霉菌和放线菌则应选择孢子成熟阶段进行保存。

第三，应尽量减少不必要的传代次数。许多实验室采用“三级菌种管理模式”，即长期保藏菌种、工作保藏菌种和日常使用菌种分级管理，从而降低菌种退化风险。

第四，应定期开展菌种质量复核，包括存活性检查、纯度检查以及典型性状确认。对于重要菌株，还应进行遗传稳定性评价。

最后，对于涉及病原微生物或具有潜在风险的菌种，应严格按照实验室生物安全要求进行保存和管理，确保菌种安全可控。

建立规范的菌种管理体系同样重要

在现代实验室管理中，菌种保藏不仅仅是把菌株放进冰箱那么简单。一个完善的菌种管理体系应覆盖菌种接收、鉴定、编号、保藏、复苏、传代、使用、转移以及销毁等全过程。

特别是在药品微生物检验、食品检测、环境监测以及医疗机构实验室中，菌种管理已经成为质量体系审核的重要内容。规范的菌种档案、完整的使用记录以及可追溯的保藏信息，都是保证实验结果准确可靠的重要基础。

结语

菌种保藏是微生物实验室最基础却又最容易被忽视的工作之一。无论是短期保存的工作菌株，还是需要长期保存的重要标准菌株，都应根据微生物特性选择科学合理的保藏方法。传代培养适用于短期使用，液体石蜡和砂土保藏适用于部分特殊菌种，而冷冻保存和冷冻真空干燥则是现代实验室长期保存菌种的主要技术路线。

作为微生物培养基与实验室解决方案服务商，逗点生物建议实验室建立完善的菌种保藏与管理制度，规范菌种全生命周期管理，确保菌种资源长期稳定、安全可追溯，为微生物检测、科研创新和生产应用提供可靠保障。