无菌检查方法适用性试验：为什么做、怎么做、如何判定？

无菌检查是无菌药品、生物制品、医疗相关产品及部分无菌原辅料质量控制中的关键项目。它的目的，是在规定条件下检查供试品中是否存在可检出的活微生物。但在实际检验中，并不是把样品直接接种到培养基中就一定能得到可靠结果。许多供试品本身可能含有抑菌成分、防腐剂、抗生素、表面活性剂或其他影响微生物生长的物质，如果不先确认方法是否适用，就可能出现“样品中有菌却长不出来”的假阴性风险。

因此，在建立某一产品的无菌检查方法时，应进行方法适用性试验。该试验的核心目的，是确认供试品在所设定的检验条件下无抑菌活性，或其抑菌活性已经通过稀释、冲洗、中和、灭活等方式被有效消除，从而保证所采用的方法适用于该产品的无菌检查。当产品的生产工艺、原辅料组成、包装形式、检验条件或供试品处理方式发生改变时，也应重新评估或重新进行方法适用性试验。

一、方法适用性试验的基本思路

无菌检查方法适用性试验并不是单纯验证培养基本身是否能长菌，而是要验证“供试品 + 检验方法 + 培养条件”这一整体体系是否能够检出少量污染微生物。

试验时，应按照供试品无菌检查拟采用的方法进行操作，并对每一种规定试验菌逐一确认。每种菌的接种量通常应小于 100 CFU，以模拟低水平污染状态。如果在含供试品的试验体系中，试验菌能够与阳性对照相似地生长，说明该检验条件下供试品的抑菌作用已被消除或可以忽略；如果生长微弱、延迟或不生长，则说明该方法尚不适用，需要调整方法后重新验证。

常用无菌检查培养基包括硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。硫乙醇酸盐流体培养基通常简称 FTM，主要用于厌氧菌培养，也可支持部分需氧菌生长；胰酪大豆胨液体培养基通常简称 TSB，适用于需氧菌、真菌及部分营养要求不高的微生物培养。

二、常用试验菌及培养基选择

方法适用性试验通常选用能代表不同类型污染风险的标准试验菌，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、芽孢菌、厌氧菌、酵母菌和霉菌。不同试验菌应接种到相应培养基中，以便观察其能否在供试品存在的条件下正常生长。

在某些方法适用性试验中，也可根据产品特性或污染风险增加企业生产环境、原料或产品历史中曾检出的常见污染菌。这样做的意义在于，标准试验菌可覆盖典型微生物类型，而环境分离菌则更贴近该产品的实际污染风险，有助于判断方法对真实污染菌的检出能力。

三、薄膜过滤法方法适用性试验

薄膜过滤法是无菌检查中常用的方法，尤其适用于具有一定抑菌活性的供试品。其原理是将供试品通过滤膜过滤，使可能存在的微生物截留在滤膜上，再通过冲洗去除供试品中的抑菌成分，最后加入培养基培养观察。

进行薄膜过滤法方法适用性试验时，通常将规定量供试品按拟采用的无菌检查方法过滤，并按规定冲洗。可在最后一次冲洗液中加入小于 100 CFU 的试验菌，再进行过滤；也可在最终培养体系中直接加入规定数量的试验菌，用于确认供试品残留或冲洗条件对微生物生长是否有影响。各试验菌应逐一验证。

滤膜过滤和冲洗操作中应注意流速不宜过快。流速过快可能使滤膜受压过大，也可能影响微生物在滤膜上的截留和存活。每张滤膜每次冲洗量通常为 100 mL，总冲洗量一般不宜超过 500 mL，必要时最高不超过 1000 mL。冲洗量过少可能无法去除抑菌成分，冲洗量过大则可能损伤截留在滤膜上的微生物，反而降低检出能力。

为发挥滤膜最大过滤效率，供试品溶液和冲洗液应尽量覆盖整个滤膜表面，避免局部干膜或流路不均。常规滤膜直径多为约 50 mm；若使用其他规格滤膜，应根据滤膜面积调整供试液、稀释液和冲洗液体积，并重新进行方法适用性确认。

四、直接接种法方法适用性试验

直接接种法是将规定量供试品直接加入相应培养基中培养观察。该方法操作相对简单，适用于无明显抑菌活性或抑菌活性可通过稀释消除的供试品。但对于含抗菌成分、防腐剂或高浓度活性物质的样品，直接接种法更容易受到抑菌作用影响。

进行直接接种法方法适用性试验时，可取适宜装量的 FTM 培养基和 TSB 培养基，分别加入相应试验菌。每管或每个容器加入的菌量应小于 100 CFU。对于每一种试验菌，通常设置含供试品的试验组和不含供试品的阳性对照组。含供试品组按拟定检查方法加入规定量供试品，阳性对照组加入等量试验菌但不加入供试品。

培养时间一般不超过 5 天，用于观察试验菌能否在供试品存在条件下恢复并生长。需要强调的是，方法适用性试验的培养时间短于正式无菌检查的观察周期，其目的不是判断样品是否无菌，而是确认方法是否能支持少量试验菌被检出。

五、结果如何判定？

方法适用性试验的结果判定重点，是比较含供试品组与阳性对照组的微生物生长情况。

如果含供试品的各容器中试验菌均生长良好，并且与阳性对照容器中的生长结果相似，说明供试品在该检验条件下无明显抑菌作用，或其抑菌作用已被有效消除，可按该方法进行供试品无菌检查。

如果含供试品的任一容器中出现微生物生长微弱、生长缓慢或不生长，而阳性对照生长正常，则说明供试品在该条件下仍存在抑菌作用，当前方法不适用。此时不能简单判定供试品无菌，而应调整检验方法，并重新进行方法适用性试验。

阳性对照必须生长良好，否则说明试验菌活性、接种量、培养基或培养条件存在问题，试验结果无效。无菌操作过程也应设置必要阴性对照，确认培养基、稀释液、冲洗液和操作过程未受到外源污染。

六、供试品有抑菌作用怎么办？

对于具有抗菌活性的供试品，应根据其抑菌作用强弱和样品特性选择合适的消除方法。

采用薄膜过滤法时，可通过增加冲洗量、优化冲洗液组成、增加培养基用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜材质等方式降低供试品残留抑菌作用。对于某些易吸附在滤膜上的抗菌成分，滤膜材质的选择也很重要，不同材质对药物或防腐剂的吸附能力不同，可能影响冲洗效果和微生物恢复。

采用直接接种法时，可通过增加培养基体积、提高稀释倍数、在稀释液或培养基中加入中和剂、灭活剂或表面活性剂等方式消除抑菌性。例如，对于含防腐剂或表面活性成分的样品，可能需要加入适宜中和体系；对于含抗生素类成分的样品，则可能需要通过薄膜过滤和充分冲洗降低药物残留。

需要注意的是，中和剂、灭活剂或表面活性剂本身也可能影响微生物生长。因此，一旦使用这些辅助试剂，应证明其有效性，同时确认其对试验菌无毒性或无明显抑制作用。不能为了消除供试品抑菌性而引入新的微生物抑制因素。

七、操作环境与无菌控制

方法适用性试验涉及活菌接种，应在符合要求的生物安全环境中进行菌液制备和接种操作，同时应避免在洁净无菌检查区内进行容易产生污染风险的菌液操作。整个过程既要保证人员和环境安全，也要防止外源微生物污染影响结果。

供试品过滤、冲洗、培养基灌注、接种和培养转移过程都应严格执行无菌操作。由于方法适用性试验加入的是低数量试验菌，操作误差、菌液混匀不均、吸附损失或污染都会影响结果判断。因此，试验前应确认菌悬液浓度、接种量、培养基灵敏度和培养条件。

八、正式无菌检查必须使用已确认的方法

已经完成方法适用性试验的供试品，在正式无菌检查时应采用与验证时一致的方法。包括供试品用量、处理方式、过滤条件、冲洗液种类、冲洗量、滤膜类型、培养基种类、培养基体积、中和剂使用情况、培养温度和培养时间等关键条件，都应与方法适用性试验确认的条件保持一致。

如果正式检验时随意改变冲洗量、培养基体积、滤膜材质或中和剂体系，原有方法适用性结论可能不再适用。尤其是具有抑菌活性的供试品，方法条件的细小变化都可能影响微生物能否恢复生长，从而影响无菌检查结果的可靠性。

九、小结

无菌检查方法适用性试验的本质，是确认所采用的无菌检查方法能否在供试品存在的条件下检出少量污染微生物。它不是形式化验证，而是防止假阴性结果的重要质量控制环节。

薄膜过滤法适合多数可过滤样品，尤其适用于具有抑菌活性的供试品；直接接种法操作简单，但更容易受到供试品抑菌作用影响。无论采用哪种方法，都应使用规定试验菌逐一确认，并与阳性对照比较生长情况。若供试品存在抑菌作用，应通过冲洗、稀释、中和、灭活或更换滤膜等方式消除，并重新验证。

对于药品和相关无菌产品而言，只有经过方法适用性试验证明适用的方法，才能用于正式无菌检查。方法适用性试验做得是否充分，直接关系到无菌检查结果的准确性、可靠性和产品质量风险判断。