婴幼儿配方奶粉中嗜热菌检验：原理、操作要点与结果计算

嗜热菌是指能够在较高温度条件下生长繁殖的一类微生物。在乳粉、婴幼儿配方奶粉等干燥乳制品中，嗜热菌的存在具有一定质量指示意义。它们可能来自原料乳、蒸发浓缩、喷雾干燥、管道设备、环境粉尘或加工过程中形成的耐热污染。由于部分嗜热菌或其芽孢可耐受较高温度，普通热处理并不一定能完全消除，因此在婴幼儿配方奶粉风险监测和质量控制中，嗜热菌检测具有重要意义。

根据《国家食品污染物和有害因素风险监测工作手册》相关方法，婴幼儿配方奶粉中嗜热菌检测通常采用倾注平板计数法。样品经稀释后接种于含 0.1% 脱脂奶粉的平板计数琼脂（MPC）培养基中，于 55℃±1℃培养 48 h±2 h，随后选择适宜菌落数范围的平板进行计数，并以 CFU/g 报告结果。

一、嗜热菌检测的基本思路

嗜热菌检测属于定量检测。其核心流程包括样品稀释、选择适宜稀释度、倾注培养基、较高温度培养、菌落计数、结果计算和报告。与普通菌落总数检测相比，嗜热菌检测的关键区别在于培养温度较高，通常采用 55℃±1℃，从而筛选出能在该温度下生长的菌群。

婴幼儿配方奶粉属于低水分食品，微生物在其中通常不容易快速增殖，但干粉中可能存在耐热或耐干燥微生物。检测时需要先用无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水充分复水和分散样品，使样品中的微生物尽可能均匀分布，再进行系列稀释和倾注培养。

MPC 培养基中加入脱脂奶粉，有助于模拟乳制品相关营养环境，提高部分乳品来源嗜热菌的恢复和生长能力。脱脂奶粉不应含有抗生素类物质，否则可能抑制目标菌生长，影响计数结果。

二、样品稀释与接种操作

检测时，称取 25 g 样品置于盛有 225 mL 无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水的无菌均质杯中，8000 r/min～10000 r/min 均质 1～2 min；也可将样品加入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1～2 min，制成 1:10 样品匀液。

随后，用 1 mL 无菌吸管或无菌吸头吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢加入含 9 mL 稀释液的无菌试管中。操作时吸管或吸头尖端不要触及稀释液面，以减少交叉污染和液体挂壁误差。混匀后制成 1:100 样品匀液。按同样方法继续进行 10 倍系列稀释，每递增一个稀释度，应更换新的无菌吸管或吸头。

根据样品污染状况预估，选择 2～3 个适宜稀释度。每个稀释度吸取 1 mL 样品匀液加入无菌培养皿中，每个稀释度做两个平行皿。同时，应分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌培养皿中作为空白对照。空白对照用于判断稀释液、培养基、培养皿和操作过程是否受到污染，是结果有效性的重要依据。

三、倾注培养基与培养条件

接种后，应及时向培养皿中倾注 15～20 mL 已冷却至 46～50℃的 MPC 培养基。培养基可提前置于 48℃±2℃恒温装置中保温，以避免温度过高损伤菌体或温度过低提前凝固。

倾注后轻轻转动培养皿，使样品匀液与培养基充分混合。转动动作应平稳，避免培养基溅到皿盖或形成气泡。培养皿水平放置，待琼脂完全凝固后翻转培养。

平板应置于 55℃±1℃培养 48 h±2 h。培养过程中要注意防止平板干裂。由于培养温度较高，琼脂水分蒸发较快，若平板过薄、培养箱湿度不足或培养时间过长，可能导致培养基干缩、菌落变小甚至影响计数。因此，倾注量、培养箱状态和平板密封或防干措施都应符合实验室 SOP 要求。

四、MPC 培养基的组成与作用

制备时，将各成分加入蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节 pH 至 7.0±0.2，分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌 15 min。琼脂用量可根据其凝固程度调整，保证培养基在 55℃培养条件下仍能保持良好凝胶状态。脱脂奶粉原料应确认不含抗生素或抑菌物质，以免影响检测结果。

五、稀释液的选择

嗜热菌检测中常用稀释液包括无菌磷酸盐缓冲液和无菌生理盐水。二者均可用于样品稀释和微生物分散，但作用略有不同。

无菌磷酸盐缓冲液具有一定缓冲能力，可减少样品稀释过程中 pH 波动对微生物的影响。其贮存液通常由磷酸二氢钾配制，经氢氧化钠调节 pH 至 7.2 后定容保存；使用时取一定量贮存液稀释成工作稀释液，并经 121℃高压灭菌 15 min。

无菌生理盐水通常为 0.85% 氯化钠溶液，即每 1000 mL 蒸馏水中加入 8.5 g 氯化钠，121℃高压灭菌 15 min。它可维持基本渗透压，适用于多数常规样品稀释。实际检测时，应按方法规定或实验室验证结果选择稀释液。

六、菌落计数规则

培养结束后，可用肉眼观察菌落，必要时使用放大镜或菌落计数器辅助计数。计数时应记录稀释倍数和对应平板菌落数，结果以菌落形成单位 CFU 表示。

通常选择菌落数在 30～300 CFU 之间、且无蔓延菌落干扰的平板进行嗜热菌计数。低于 30 CFU 的平板应记录具体菌落数；大于 300 CFU 的平板可记录为多不可计。若出现蔓延菌落、污染菌落或培养基干裂，应根据实际情况判断该平板是否可用于计数。

计数时应注意区分真正菌落与培养基颗粒、气泡、乳粉沉淀或杂质。MPC 培养基含有脱脂奶粉，若溶解或灭菌状态不佳，可能出现细小颗粒，对计数造成干扰。因此，培养基制备时应充分溶解并保持均一。

七、嗜热菌结果如何计算？

若只有一个稀释度的两个平板菌落数在适宜计数范围内，则计算两个平板菌落数的平均值，再乘以相应稀释倍数，作为每克样品中嗜热菌结果。

若两个连续稀释度的平板菌落数均在适宜计数范围内，则按常见平板计数公式计算：

N = ΣC / [(n1 + 0.1n2) × d]

其中，N 为样品中嗜热菌菌落数；ΣC 为所有纳入计算平板的菌落数之和；n1 为第一稀释度，即低稀释倍数平板个数；n2 为第二稀释度，即高稀释倍数平板个数；d 为第一稀释度的稀释因子。

例如，若 10⁻² 稀释度两个平板分别为 160、150 CFU，10⁻³ 稀释度两个平板分别为 38、32 CFU，则 ΣC=380，n1=2，n2=2，d=10⁻²。
N=380 / [(2+0.1×2)×10⁻²] = 380 / 0.022 ≈ 17272.7 CFU/g，按修约规则可报告为 1.7×10⁴ CFU/g。

八、特殊计数情况如何处理？

若所有稀释度平板菌落数均大于 300 CFU，可对最高稀释度平板进行计数，其他平板记录为多不可计，结果按最高稀释度平板的平均菌落数乘以对应稀释倍数计算。

若所有稀释度平板菌落数均小于 30 CFU，则按最低稀释度平板的平均菌落数乘以对应稀释倍数计算。

若所有稀释度平板均无菌落生长，则以“小于 1 乘以最低稀释倍数”报告。例如最低稀释度为 10⁻¹，接种量为 1 mL，则可按小于 10 CFU/g 的形式表达，具体报告方式应按方法要求执行。

若所有稀释度平板菌落数均不在 30～300 CFU 范围内，其中一部分小于 30 CFU，另一部分大于 300 CFU，则选择最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。该类结果应谨慎解释，必要时可在报告或原始记录中注明计数情况。

九、结果报告与修约

结果以 CFU/g 为单位报告。菌落数小于 100 CFU 时，按四舍五入原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字按四舍五入原则修约，采用两位有效数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式表示，并保留两位有效数字。

例如，87 CFU/g 可报告为 87 CFU/g；1260 CFU/g 可报告为 1300 CFU/g 或 1.3×10³ CFU/g；17272.7 CFU/g 可报告为 1.7×10⁴ CFU/g。

若空白对照上有菌落生长，说明稀释液、培养基、培养皿或操作过程可能受到污染，此次检验结果无效，应查找原因后重新检测。空白对照污染不能忽略，也不应简单从样品计数中扣除。

十、操作中的关键质量控制点

嗜热菌检测虽然流程类似普通平板计数，但有几个关键点更需要关注。

首先，样品复水和均质必须充分。奶粉容易结团，若样品没有完全分散，微生物可能分布不均，导致平行皿差异大。

其次，培养基温度要控制在 46～50℃。温度过高可能损伤菌体，温度过低则容易提前凝固，影响样品与培养基混合。

第三，55℃培养时要防止平板干裂。培养基过薄、培养箱湿度不足或平板密封不当，都可能影响菌落形成。

第四，空白对照必须同时设置。空白对照有菌落时，不能报告样品结果。

第五，计数时应选择无蔓延菌落且菌落数适宜的平板。蔓延菌落会遮盖其他菌落，影响准确计数。

第六，培养基中的脱脂奶粉应无抗生素或抑菌物质。若原料异常，可能造成嗜热菌计数偏低。

十一、小结

婴幼儿配方奶粉中嗜热菌检测主要采用 MPC 培养基倾注平板计数法。样品经 1:10 初始稀释和 10 倍系列稀释后，选择适宜稀释度接种平板，倾注 46～50℃ MPC 培养基，凝固后于 55℃±1℃培养 48 h±2 h，选择 30～300 CFU 范围内的平板进行计数。

该方法的关键在于样品充分均质、稀释准确、培养基温度合适、培养过程中防止平板干裂、空白对照合格以及结果计算规范。嗜热菌检测结果可反映婴幼儿配方奶粉生产过程中的耐热污染控制水平，对原料、设备清洗、热处理、干燥和包装环境管理具有重要参考价值。