非选择性培养基用于微生物菌落筛选和鉴定的方法

在牛乳、土壤、水和食品等样品中，微生物往往不是单一菌种，而是由多种细菌、酵母或霉菌共同组成的混合群落。使用非选择性培养基进行平板计数时，培养基通常允许多类微生物同时生长，因此平板上可能出现大小、颜色、形态和透明度不同的菌落。此时，实验室不仅关心总菌落数，还常需要估算不同类型菌落的相对比例，并进一步挑取代表性菌落进行纯化、鉴定或生理特性测试。

非选择性培养基的优势是抑制性较弱，能尽可能恢复和显示样品中的可培养微生物；但它的局限也很明显：不同菌落形态并不一定代表不同菌种，相同菌种也可能因培养时间、营养状态或环境压力表现出不同形态。因此，菌落筛选不能只凭“看起来特殊”来挑选，而应采用系统、随机或分层的方法，尽量获得具有代表性的菌落集合。

一、为什么不能随意挑选菌落？

从混合菌平板上挑选菌落时，若操作者只挑取颜色明显、个体较大或形态特殊的菌落，就容易造成抽样偏差。数量占优势但形态普通的菌落可能被过度挑取，而数量很少但具有重要意义的菌群则可能被忽略。

例如，某一类目标菌在平板菌落中只占很低比例时，如果只检测少量菌落，很可能完全抽不到该类菌。相反，如果抽样策略合理，即使目标菌比例较低，也能提高发现概率。因此，在非选择性培养基上进行菌落筛选时，关键不是“挑最典型的菌落”，而是“按规则挑取能够代表平板总体结构的菌落”。

二、用非选择性培养基估算菌群组成的基本思路

使用非选择性培养基计数后，可先观察平板上菌落的形态类别，如大小、颜色、边缘、隆起度、透明度、表面质地、是否产色素、是否形成晕圈等。随后按一定规则挑取菌落，转接至斜面、平板或鉴定培养基，进行纯化和后续鉴定。

若目标是估算不同微生物类型在原始样品中的分布百分比，可先统计平板总菌落数，再按代表性抽样获得不同类型菌落的比例，最终估算原始样品中各类可培养微生物的大致构成。

需要强调，非选择性培养基得到的是“可培养微生物”结果，不等于样品中所有微生物的真实组成。某些菌可能在该培养条件下不生长或生长很弱，因此结果应解释为特定培养条件下的群落结构。

三、方法一：选择平板上的每一个菌落

当平板上菌落数量较少时，最直接的方法是选择平板上的每一个菌落进行后续检测。这种方法的优点是覆盖完整，不需要抽样推断，获得的检测数量与平板菌落数大致相等。

这种方法适合菌落数量不多、样品重要、需要尽可能完整分析的场景。例如，特殊食品腐败样品、生产异常样品、低菌量水样或科研实验中的小规模筛选。

四、方法二：扇形区段抽样

当平板菌落数量较多，不可能逐一检测时，可采用扇形区段抽样。操作时，可用油性记号笔在培养皿底部划分扇区，如四等分、八等分或更多区段，然后选择一个或多个规定扇区中的所有菌落进行检测。为了减少空间分布偏差，可选择相对扇形区，即相隔一定角度的两个或多个扇区。

扇区抽样的关键是：一旦确定某个扇区，就应统计和挑取该扇区内所有符合要求的菌落，而不是只挑其中看起来特殊的菌落。位于标记线上的菌落可按实验室预先规定统一处理，如忽略不计或按固定规则归入某一区域，避免重复计数。

五、哈里逊板：一种辅助代表性取样的模板

旧资料中提到的哈里逊板，可理解为一种用于辅助平板菌落抽样的扇区模板。使用时，将待检测培养皿同心放置在模板上，按模板中标记的区域顺序选择菌落。例如，先选择标记为“1”的区域内所有菌落进行检测；若数量不足，再选择“2”区域；仍不足时继续选择“3”“4”等区域，直到达到所需菌落数量。

这种方法的优点是使挑菌过程更加规则化，减少操作者主观选择。它尤其适合平板上菌落数量较多，但实验室只需检测其中一部分代表性菌落的情况。

六、方法三：复制平板法

复制平板法适用于需要同时检测同一批菌落多种生理特性的情况。如果原始平板表面已有分散菌落，可用复制工具将菌落的相对位置整体转移到多个新平板上。这样，每个新平板上的菌落排列与原始平板基本一致，便于比较同一菌落在不同培养基或不同条件下的生长表现。

最简单的复制工具可由无菌绒布垫和圆柱形支撑体组成。将灭菌绒布垫固定在圆柱体一端的平面上，轻轻压在原始培养基表面，使菌落细胞附着到绒布上；随后依次轻压到多个已准备好的培养基平板上，使菌落图案复制到各个平板。最后可压印到一个对照培养基上，用于检查转移是否成功。

复制平板法的价值在于“保留空间位置”。当某个菌落在特定检测平板上表现出目标性状时，可根据位置对应关系回到原始平板或营养平板上挑取该菌落进行纯化。

七、复制平板操作中的关键控制点

复制平板法看似简单，但对工具灭菌、平板表面干燥程度和操作力度要求较高。平板表面过湿时，菌落容易被拖动，导致位置错乱；平板过干或菌落太老时，转移效率可能降低。压印时力度应轻而均匀，避免破坏菌落或琼脂表面。

旧资料中提到通常可转移9个检测平板加1个对照平板。实际数量应根据菌落量、绒布转移效率、检测目的和实验室验证结果确定。复制次数过多时，后续平板上的菌量可能逐渐减少，导致假阴性。

八、绒布垫的清洗和重复使用

若绒布垫需要重复使用，应先放入装水容器中，经过高压灭菌清除污染，再进行洗涤、漂洗、干燥、梳理和再次高压灭菌。这样可以去除残留菌体、培养基成分和代谢产物，避免交叉污染和假阳性。

在条件允许时，更推荐使用一次性或专用灭菌复制垫，以降低污染和残留风险。若重复使用绒布垫，应建立清洗、灭菌和有效性验证流程，并定期检查绒布是否破损、脱纤维或转移效率下降。

九、菌落筛选后的鉴定流程

无论采用全部挑取、扇区抽样还是复制平板法，筛选出的菌落都应进行纯化。常见做法是将菌落划线接种到非选择性营养平板或适宜培养基上，培养后观察是否形成单一菌落形态。纯化后再进行革兰氏染色、氧化酶、触酶、生化鉴定、分子鉴定或其他功能试验。

非选择性培养基上的菌落形态只能作为初步线索，不能作为最终鉴定依据。尤其在环境样品和食品样品中，许多不同菌种可能形成相似菌落，必须通过进一步试验确认。

十、常见问题与控制建议

十一、质量控制建议

用于菌落筛选和鉴定的非选择性培养基应具备良好的促生长能力、稳定的pH、适宜的凝胶强度和清晰的菌落形态表现。若培养基营养不足或批间差异较大，会影响某些菌群的恢复，导致群落比例估算偏差。

实验室应记录所用培养基名称、批号、培养温度、培养时间、平板菌落总数、抽样方法、抽取菌落数和后续鉴定结果。若需要比较不同批次样品或不同处理条件下的菌群结构，应尽量保持培养基、培养时间、温度和抽样规则一致。

小结

非选择性培养基常用于牛乳、土壤、水和食品等混合微生物样品的计数、筛选和初步鉴定。由于平板上不同菌落的分布可能不均，随意挑选菌落容易造成结果偏差。常用的代表性筛选方法包括：选择平板上每一个菌落、按扇形区段抽样、使用哈里逊板等模板抽样，以及利用复制平板法同时检测多个生理特性。

在实际应用中，应根据平板菌落数、所需检测菌落数量和实验目的选择方法。若菌落数少，可全部挑取；若菌落数多，可采用扇区或模板抽样；若需要比较同一批菌落在多个培养基上的表现，可采用复制平板法。无论采用哪种方法，最终鉴定都应建立在纯培养和后续确认试验基础上，而不是仅凭菌落外观判断。