无菌检查法中的浮游菌测试：洁净环境微生物监控的关键环节

无菌检查不仅依赖培养基、供试品处理方法和检验人员操作，还高度依赖检验环境的洁净状态。对于无菌检查室、隔离系统、洁净工作台和无菌操作区域而言，空气中悬浮的微生物是重要污染来源之一。因此，在无菌检查及相关洁净区环境监控中，浮游菌测试是一项非常重要的微生物监测项目。

浮游菌是指空气中附着在尘埃、液滴或微粒上的活微生物。它们可能来源于人员活动、物料转移、设备运行、空气系统波动或清洁消毒不充分等因素。通过浮游菌测试，可以评价洁净区空气微生物污染水平，为无菌检查环境控制、洁净区确认和日常监测提供依据。

一、浮游菌测试的基本原理

浮游菌测试通常使用专门的空气微生物采样器完成，常见原理为撞击法。采样器通过设定流量吸入一定体积的空气，使空气中的微生物颗粒撞击并沉降到培养基表面。培养后，通过计数培养皿上的菌落数，换算为空气中浮游菌浓度，通常以 CFU/m³ 表示。

撞击式空气采样器根据结构不同，可分为狭缝式、离心式、针孔式或多孔筛板式等类型。无论使用哪种设备，都应配有流量控制装置和定时装置，并按照仪器说明书操作和定期校验。采样器流量、采样时间、采样头孔径、撞击速度和培养基表面状态，都会影响浮游菌回收率和计数准确性。

用于洁净区监测的采样器应保持清洁、完好并按规定校准。用于 A 级洁净区域的采样器，宜预先放入被测房间或操作区域内，经表面消毒后使用。采样口、采样头、采样管及与空气直接接触的部件，使用前应经过灭菌或经验证的消毒处理。采样结束后，也应按规程对采样器内壁、转盘或采样头进行清洁消毒，防止残留微生物影响下一次监测。

二、浮游菌测试常用培养基

浮游菌测试常用培养基为 胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），也可使用其他经验证适用的培养基。TSA 营养较全面，可支持多数细菌和部分真菌生长，因此常作为洁净区空气微生物监测的通用培养基。

当监测结果中疑似真菌较多，或季节、湿度、环境特点提示真菌污染风险增加时，可增加 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）。SDA 更适合霉菌和酵母菌生长，可提高真菌污染的检出能力。实际监测中，可根据洁净区用途、历史监测数据、污染菌谱和风险评估决定是否同时使用 TSA 和 SDA。

如果监测环境中可能存在消毒剂、抗生素、防腐剂或其他抑菌物质残留，培养基中可加入适当中和剂。例如，在频繁使用消毒剂的区域，若空气采样过程中消毒剂残留可能影响微生物恢复生长，应确认所用培养基和中和体系能够有效中和抑菌成分，同时不抑制微生物生长。培养基是否适用，不能只看配方名称，还应结合促生长能力、污染控制和实际监测场景进行确认。

三、培养基预培养与使用前检查

用于环境监控的培养基宜采用多层包装，并尽量采用终端灭菌方式，以降低培养基本身带入污染的风险。如果使用的培养基不能终端灭菌，或为外购即用型平板，则在使用前应根据风险进行预培养或污染检查，确认培养基本身无污染。

常规情况下，TSA 平皿可倒置于 30～35℃ 培养不少于 24 h；SDA 平皿可正置或按企业规程于 20～25℃ 培养不少于 48 h。预培养条件可根据培养基类型、供应商质量资料、历史数据和实验室验证结果适当调整。

预培养的目的，是提前发现培养基在生产、运输、储存或打开包装过程中可能存在的污染，避免将污染平皿带入洁净环境，造成假阳性结果或额外污染风险。预培养后的培养基还应检查外观是否正常，如表面是否干裂、过度失水、冷凝水过多、污染菌落或培养基脱落等。异常平皿不应继续用于浮游菌监测。

四、采样前准备与人员要求

浮游菌采样人员应穿戴与被测洁净区域相匹配的洁净服，并按洁净区更衣和行为规范操作。进入 A 级或关键操作区域进行采样时，应尽量减少动作幅度和停留时间，避免采样人员自身成为主要污染源。

操作过程中应全程佩戴无菌手套，必要时对手套表面进行消毒。采样器和培养皿转移过程中应防止外包装、人员手部或设备表面污染培养基。用于 A 级区域的采样器在进入关键区域前应完成外表面擦拭消毒，并确认采样部件已经灭菌或消毒合格。

采样前，应先开启采样器空转一定时间，使仪器内部可能残留的消毒剂充分挥发。原始资料中建议不少于 5 min。随后检查仪器流量，根据计划采样体积设定采样时间。若流量不稳定或偏离校准范围，应停止使用并进行维护或校准。

五、采样体积与采样点布置

浮游菌采样体积应根据洁净级别、监测目的和评定标准确定。原始资料中提到：A 级洁净度每个采样点采样体积不少于 1000 L；C 级洁净度每个采样点采样体积为 500 L；其他洁净度每个采样点采样体积为 100 L。实际执行时，应结合现行法规、企业环境监测方案、洁净区级别和历史数据确定，并保持方法一致性。

采样点数量和位置应覆盖关键操作区域、人员活动区域、物料转移路线、回风或气流风险点等。布点应尽量均匀，但对于高风险位置应适当增加采样点。例如，无菌检查操作台、关键暴露区域、培养基灌装点、样品开封处、传递窗附近等，通常应作为重点监测位置。

浮游菌测试应主要参考 GB/T 16293—2010《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》。若同时进行悬浮粒子监测，则悬浮粒子测试应参考 GB/T 16292—2010。两者监测对象不同：悬浮粒子反映空气中非生物或总颗粒污染水平，浮游菌反映空气中可培养微生物污染水平，不能互相替代。

六、采样操作流程

采样时，将已预培养合格并恢复至适宜状态的培养皿放入采样器，安装无菌采样头或采样盖。将采样口置于预定采样点，避免采样气流直接受到人员呼吸、手部动作或设备排风的干扰。确认采样体积和时间后启动仪器。

采样过程中，应避免移动采样器或触碰采样头，以免影响空气流场和采样结果。采样结束后，取出培养皿并立即盖好皿盖，做好样品编号、采样点、采样体积、采样时间、洁净级别、培养基批号和操作人员等记录。

对于多点采样，应注意采样顺序和培养皿暴露时间，避免培养基在非采样状态下长时间暴露。若采样过程中出现培养皿污染、培养基破损、仪器报警、流量异常或采样中断，应按偏差处理，必要时重新采样。

七、培养与计数

采样后的 TSA 平皿通常倒置于 30～35℃ 培养约 48 h，用于细菌计数。SDA 平皿通常于 20～25℃ 培养约 5 d，用于霉菌和酵母菌计数。具体培养条件可根据企业规程、培养基验证结果和监测目的进行确认。

培养结束后，应检查每个平皿的菌落数，并记录菌落形态。若需要进行趋势分析或污染溯源，可对代表性菌落进行分离、纯化和鉴定。对于关键区域检出的菌落，尤其是 A 级区域或无菌检查关键操作区域，应结合环境监控规程进行调查和评估。

浮游菌浓度通常按以下公式计算：

平均浓度（CFU/m³）= 菌落数 ÷ 采样体积（m³）

例如，某采样点采样 1000 L，即 1 m³，培养后计数 1 个菌落，则结果为 1 CFU/m³；若采样 500 L，即 0.5 m³，培养后计数 2 个菌落，则结果为 4 CFU/m³。

八、Feller 校正的意义

撞击式空气采样器在采样时，多个微生物颗粒可能通过同一个采样孔或撞击到培养基表面相近位置，最终形成一个可见菌落。此时直接计数的菌落数可能低于实际被采集的活微生物数。为减少这种统计偏差，部分多孔撞击式采样器需要采用 Feller 校正 对计数结果进行修正。

是否需要 Feller 校正，应根据采样器类型、采样头孔数、设备说明书和验证文件确定。并非所有采样器都采用同一校正方式。实际记录中，应注明使用的采样器型号、采样头孔数、原始菌落数、是否进行校正以及校正后的结果。最终用于趋势分析和限度判断的数据，应与企业规程保持一致。

九、结果评价与异常处理

每个测试点的浮游菌平均浓度应低于所选评定标准或企业内控限度。评价时不应只关注单次是否超标，还应结合历史趋势、洁净区级别、生产或检验活动状态、人员操作、消毒周期和设备运行状态综合判断。

如果浮游菌结果接近警戒限或超过行动限，应及时调查可能原因。常见原因包括人员操作不当、采样器消毒不充分、培养基本身污染、洁净服穿戴不规范、空调净化系统异常、清洁消毒不到位、物料传递污染、门频繁开启或气流组织受扰等。

对于关键区域的异常结果，必要时应进行复测、污染菌鉴定、环境清洁消毒效果评估和相关操作回顾。若异常结果可能影响无菌检查或产品质量，应按偏差管理程序进行风险评估。

十、小结

浮游菌测试是无菌检查环境监控的重要组成部分，主要用于评价洁净区空气中可培养微生物的污染水平。其准确性受到采样器性能、培养基质量、采样体积、采样点布置、人员操作、培养条件和计数校正等多因素影响。

在实际工作中，应选用经校准和验证的空气采样器，使用适宜的 TSA 或 SDA 培养基，严格执行采样、培养、计数和 Feller 校正规程。对于无菌检查关键区域，浮游菌监测不仅是合规要求，更是发现环境污染风险、保障无菌检查结果可靠性的重要手段。