菌种的复苏与传代：消毒试验用微生物管理的基础环节

在微生物检测和消毒效果评价中，菌种质量直接影响试验结果的准确性和可重复性。即使使用同一标准菌株，如果复苏、传代、培养条件或记录管理不规范，也可能出现菌株活力下降、典型性状改变、污染或代次不清等问题。因此，菌种复苏与传代是实验室菌种管理中最基础、也最容易被忽视的关键环节。

根据 WS/T 683—2020《消毒试验用微生物要求》的相关内容，消毒试验用微生物在使用前应按照规定方法进行复苏和传代，并根据菌种类型选择合适的培养基和培养条件。不同微生物的营养需求、生长速度和培养温度不同，不能用同一种培养方式处理所有菌种。

一、什么是菌种复苏？

菌种复苏是指将冻干菌种、冷冻保存菌种或瓷珠保存菌种恢复到可生长状态的过程。冻干菌种在保存过程中处于休眠或低代谢状态，直接用于试验可能存在活力不足、分散不均或生长延迟等问题。因此，使用前通常需要先用适宜培养液使菌体充分水化、分散，并在适宜条件下培养，获得第 1 代培养物。

复苏的目的不是简单“让菌长出来”，而是恢复菌株活性，获得形态典型、纯度可靠、状态稳定的培养物，为后续传代和试验使用打好基础。复苏过程应严格无菌操作，避免外源污染，也要避免剧烈吹打导致细胞损伤。

二、不同菌种应选择合适培养基

菌种复苏和传代时，培养基应根据菌种特性选择。常见消毒试验用微生物包括细菌、酵母菌、霉菌和分枝杆菌，不同类型菌种所需培养基并不相同。

需要注意的是，表中条件为常见参考条件，实际操作时应以标准、菌种说明书和实验室经验证 SOP 为准。尤其是分枝杆菌、霉菌等生长速度和培养表现与普通细菌不同，培养时间不宜简单套用普通细菌的 18～24 h。

三、冻干菌种的复苏流程

复苏冻干菌种时，应在无菌条件下开启菌种管，加入适量相应培养液。加入培养液后，可轻轻吹吸数次，使冻干菌体充分融化、分散，形成较均匀的菌悬液。

随后，取含 5.0～10.0 mL 相应培养液的试管，滴入少量菌种悬液，在适宜温度下培养至规定时间。一般细菌多在 36℃±1℃培养 18～24 h；黑曲霉可在 30℃±1℃培养 42～48 h。培养完成后得到的培养物称为第 1 代培养物。

第 1 代培养物主要用于恢复菌株活性，通常不建议直接用于正式试验。正式试验前还需要通过平板分离、挑取典型菌落和后续传代，确认菌株形态典型、纯度良好。

四、第 2 代培养物：平板分离与纯化

获得第 1 代培养物后，可用接种环取少量培养物，划线接种于相应培养基平板。若使用的是菌种冻存管，也可从冻存管中取适量菌液或瓷珠，直接划线接种于相应平板。

划线培养的目的是获得分离良好的单个典型菌落，便于观察菌落形态并排除混杂污染。一般细菌可接种营养琼脂培养基；白色念珠菌可接种沙氏琼脂培养基；分枝杆菌可接种改良罗氏培养基或专用分枝杆菌复合琼脂培养基；黑曲霉可接种麦芽浸膏琼脂培养基。

培养至规定时间后得到第 2 代培养物。此时应观察菌落形态是否符合该菌种典型特征，如颜色、边缘、表面形态、大小、隆起度及是否存在杂菌菌落。若平板上出现明显不同形态菌落，应进行纯化或重新复苏，不应直接进入下一步。

五、第 3 代培养物：挑取典型菌落传代

从第 2 代培养物中挑取典型菌落，接种于相应培养基斜面或平板，在适宜温度下培养至规定时间，即得到第 3 代培养物。第 3 代培养物通常是菌株状态较稳定、形态较典型的培养物，可用于继续传代、制备菌悬液或作为后续试验菌来源。

对于一般细菌，可接种营养琼脂斜面；白色念珠菌可接种沙氏琼脂斜面；分枝杆菌可接种改良罗氏培养基或其他经验证的专用斜面；黑曲霉常接种麦芽浸膏琼脂平板或斜面。霉菌类菌株应注意孢子形成状态，避免仅取到菌丝而影响后续悬液制备。

第 3 代培养物的质量非常重要。若菌落不典型、生长过弱、污染可疑或培养时间明显异常，应查明原因后再使用。对于消毒试验用菌株，不能只看“有生长”，还要确认菌株纯度、典型性和活力。

六、继续传代与代次管理

若试验需要，可取第 3 代培养物继续接种于相应培养基斜面或平板，在适宜条件下培养，得到第 4 代培养物。此后可按相同方法传代至所需代数。

传代过程中必须做好代次管理。每支试管、斜面、平板或保存管上应注明菌种名称、菌种编号、代数、传代日期、培养基名称和操作者等基本信息。记录不清会导致菌株来源和代次无法追溯，严重时会影响试验结果的合规性和可信度。

通常情况下，工作菌株不宜无限传代。传代次数越多，菌株发生性状漂移、活力变化或污染的风险越高。实验室应建立主种子批、工作种子批和使用代次管理制度，明确每种菌株允许的最高传代代数，并定期从可靠保存株重新复苏。

七、复苏与传代中的质量控制

菌种复苏与传代过程中，应重点关注三个方面：纯度、典型性和活力。

纯度是指培养物中不应混有其他微生物。可通过平板菌落形态、显微镜检查、革兰染色或必要的生化鉴定进行确认。典型性是指菌落形态、细胞形态、色素、孢子或酵母样特征应符合该菌种特点。活力则表现为在规定培养基和培养条件下能够按预期时间良好生长。

如果菌株复苏后生长缓慢、菌落形态异常或多次传代后性状不稳定，应考虑菌株保存状态、培养基质量、培养条件、传代次数和污染风险。必要时应重新启用低代次保存菌株，或从正规菌种保藏机构重新购置菌株。

八、常见问题与注意事项

复苏冻干菌种时，培养液加入量不宜过少，否则菌体不易充分分散；也不宜剧烈振荡，以免损伤部分细胞。开启菌种管和转接操作必须在合适的无菌环境中进行，防止外源污染。

划线分离时，应尽量获得单个菌落。如果第 2 代平板菌落过密，难以判断典型菌落，应重新划线分离。挑取菌落时应选择形态典型、边缘清楚、无污染迹象的菌落，不应随意挑取混杂区或异常菌落。

传代培养时间也需要控制。培养不足时，菌体可能未达到良好生长状态；培养过久时，菌体老化、芽孢化、变异或死亡比例可能增加。对于芽孢杆菌、霉菌、分枝杆菌等特殊菌株，应根据试验目的选择合适的生长阶段。

九、菌种记录与可追溯性

规范的菌种记录是实验室质量管理的重要组成部分。每一次复苏、传代、保存和使用都应有完整记录，内容包括菌种名称、菌种编号、来源、批号、复苏日期、传代代数、培养基、培养温度、培养时间、操作人员和结果观察。

对于用于消毒试验的菌株，还应记录其是否符合标准要求，是否进行纯度检查、典型性检查和必要的活菌计数。若试验结果出现异常，完整的菌种记录有助于追溯问题来源，判断是否与菌株状态有关。

十、小结

菌种复苏与传代是消毒试验用微生物管理的基础工作。复苏的目的是恢复菌株活力，传代的目的是获得纯净、典型、状态稳定的工作菌株。不同菌种应选择不同培养基和培养条件，不能用普通细菌的培养方式简单套用于酵母菌、霉菌或分枝杆菌。

在实际操作中，应严格执行无菌操作，控制传代代数，做好标签和记录，并通过菌落形态、染色或必要鉴定确认菌株纯度和典型性。只有菌种来源清楚、代次可追溯、培养状态稳定，消毒试验和微生物检测结果才具有可靠性和可比性。