大肠菌群平板计数法常见问题解析：VRBA 使用、证实试验与结果计算

大肠菌群平板计数法是食品微生物检验中常用的定量方法之一，主要用于大肠菌群含量较高的样品检测。该方法通常以结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）为分离计数培养基，通过观察典型或可疑菌落，再经煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）证实试验，最终计算样品中的大肠菌群数量。

在实际操作中，很多问题并不来自方法原理，而是来自培养基制备、倾注温度、是否覆盖、菌落挑取、证实比例和结果换算等细节。尤其对新手来说，VRBA 平板上哪些菌落该计数、哪些菌落要证实、两个连续稀释度都长菌时如何处理，都是容易出错的环节。

一、VRBA 培养基需要高压灭菌吗？

VRBA 培养基通常不进行高压灭菌，而是采用加热煮沸溶解的方式制备。其原因是 VRBA 中含有胆盐、结晶紫、中性红、乳糖等成分，过度加热或高压灭菌可能影响选择性、显色反应和培养基状态。使用时应按产品说明或标准方法要求加热溶解，避免长时间高温处理。

配制过程中用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等器具应清洗干净，表面无污渍、无残留。虽然这些器具不一定都需要预先高压灭菌，但必须保证清洁，避免将外源污染或化学残留带入培养基。培养基煮沸溶解后，瓶口应保持清洁，可用洁净透气材料临时覆盖，待冷却至适宜温度后尽快使用。

倾注培养基时，应尽量在洁净环境中操作。若实验室采用酒精灯辅助操作，应注意火焰安全，避免培养基过热、瓶口烫伤或乙醇火灾风险。VRBA 属于热熔后使用的培养基，制备后不宜长时间放置。

二、“煮沸 2 分钟”如何理解？

一些说明书或旧版操作资料中会提到 VRBA 需要煮沸约 2 min。实际操作中，重点并不是剧烈沸腾越久越好，而是使培养基充分溶解、均一透明，并尽量避免过度加热。

VRBA 在加热过程中很容易发生暴沸和喷溅，尤其是使用电磁炉、电热板或容器装量较大时。如果持续强烈沸腾，培养基可能迅速上涌，造成污染、烫伤和实验室安全风险。因此，建议在接近沸腾时适当降低加热强度，边加热边轻轻摇动，使培养基完全溶解即可。

判断是否合格，应看培养基是否完全溶解、无明显颗粒和絮状物，颜色是否正常，pH 和凝固状态是否符合要求。不能为了机械满足“2 分钟”而造成培养基喷溅、浓缩或成分破坏。

三、VRBA 未用完可以冷藏下次再用吗？

一般不建议。VRBA 配制后应尽量当天使用，未用完的培养基不宜冷藏后下次继续使用。反复冷却、凝固、再熔化会影响培养基选择性、显色反应和凝胶状态，也增加污染和喷溅风险。

对于固体培养基，部分标准允许已经灭菌并凝固的培养基在一定条件下再熔化一次使用，但 VRBA 本身对加热较敏感，再次熔融时容易出现局部未完全熔化、底部过热、突然喷溅等问题。实际工作中，建议按当天样品量合理配制，避免剩余过多。

如果实验室确需再熔化某些已凝固培养基，应严格按照标准和经验证 SOP 执行，并确认培养基性能不受影响。对于 VRBA，仍建议以新鲜配制、及时使用为优先原则。

四、VRBA 平板是否必须覆盖第二层？

VRBA 平板计数法中，覆盖第二层培养基的目的，是限制菌落蔓延、减少表面扩散，并使菌落处于较稳定的半厌氧环境中，便于形成较典型的大肠菌群菌落。是否覆盖第二层，应按现行标准和实验室 SOP 执行。

从实践角度看，如果检验员首次检测某类食品，尚不清楚该样品在 VRBA 上是否容易出现蔓延菌、扩散菌或表面干扰，建议按标准方法进行覆盖。若经过多次验证，某类样品在不覆盖时也能获得清晰、稳定、可计数的菌落，可结合标准要求和内部验证结果确定操作方式。但在正式合规检测中，不应随意省略标准规定步骤。

覆盖时应在底层培养基凝固或半凝固、平板轻轻晃动不明显流动后，再缓慢加入一层温度适宜的 VRBA，使其刚好覆盖整个平板表面。覆盖层不宜过厚，否则可能影响菌落显色和挑取；也不宜过薄，否则不能有效限制扩散。

五、如何判断 VRBA 上是不是大肠菌群？

VRBA 上的大肠菌群典型菌落通常因发酵乳糖产酸，使中性红变色，并在胆盐存在下形成红色至紫红色菌落，周围可有红色沉淀环。但不同菌株、样品基质和培养条件下，菌落大小、颜色深浅和沉淀环清晰度会有差异。

对新手来说，最稳妥的方式是严格进行 BGLB 证实试验。凡是 VRBA 上出现典型或可疑菌落，均应按要求挑取一定数量进入 BGLB 肉汤，观察是否产气。经过多批次、多样品、多形态菌落的证实对照后，检验员才能逐步建立对典型菌落形态的判断经验。

需要注意的是，VRBA 上“像大肠菌群”的菌落不一定都是大肠菌群；反过来，一些大肠菌群菌落也可能表现得不够典型。因此，平板观察是初筛，BGLB 产气证实才是结果计算的重要依据。

六、两个连续稀释度都有菌落时如何选择？

平板计数时，应优先选择菌落数处于可计数范围的平板。传统经验中，VRBA 平板可选择 15～150 CFU 范围内的平板进行计数和证实。GB 4789.3—2025 对平板法接种培养、菌落判定和两个连续稀释度处理规则做了进一步细化，正式检测应以现行标准及附录计算规则为准。

如果两个连续稀释度的平板菌落数都处于适宜计数范围，通常不能只选一个“看起来方便”的稀释度，而应按标准规则进行处理。实际操作中，可从各平板挑取典型和可疑菌落进行证实试验，并根据证实阳性比例计算经证实的大肠菌群数。

例如，1:10 稀释度两个平板菌落数分别为 120、123，1:100 稀释度两个平板菌落数分别为 16、18，四个平板均在可计数范围内。此时应按照标准规定对适宜平板进行计数、挑取和证实，不宜只挑菌落数较少的平板，以免影响结果代表性。

七、证实试验应挑取多少菌落？

证实试验的目的是确认 VRBA 上的典型或可疑菌落是否真正属于大肠菌群。一般建议按不同形态分别挑取，尤其是新手阶段，应尽可能覆盖 VRBA 上出现的主要菌落类型。

常见做法是：每种典型或可疑菌落形态挑取一定数量，例如 5 个；若菌落形态复杂、可疑类型较多，或 BGLB 肉汤管数量允许，可适当增加挑取数量。每个菌落分别接种 1 管 BGLB 肉汤，培养后观察小倒管是否产气。产气者记为大肠菌群阳性管。

挑菌时应尽量挑取独立、清晰、未融合的菌落。VRBA 平板上菌落常被覆盖层包埋，尤其是倾注法培养后，部分菌落位于琼脂内部。此时可使用较细的金属接种环或接种针，轻轻挑取目标菌落，避免带入过多琼脂或相邻菌落。一次性塑料接种环较粗时，有时不便于挑取被覆盖层包埋的小菌落。

八、BGLB 证实试验如何判定？

BGLB 肉汤含胆盐、乳糖和煌绿，既能选择性抑制部分非目标菌，又可通过乳糖发酵产气确认大肠菌群。接种后按规定温度和时间培养，观察小倒管内是否有气体。

凡 BGLB 管产气者，可判定为大肠菌群证实阳性。未产气者则不计入经证实的大肠菌群。观察时应认真检查小倒管，避免将气泡、附着气体或操作时带入的空气误判为产气。若小倒管设置异常、倒管内原有气泡无法排除，该管结果应谨慎处理，必要时重新试验。

BGLB 证实试验的准确性会直接影响最终结果。若 VRBA 上计数很多，但证实阳性比例很低，说明平板上存在较多非大肠菌群可疑菌落；若典型菌落证实率很高，则说明形态判断较可靠。

九、结果如何计算？

大肠菌群平板计数法的最终结果不是简单把 VRBA 上所有红色菌落相加，而是要结合证实试验结果计算“经证实的大肠菌群数”。

可按以下思路理解：

经证实大肠菌群数 = 某类菌落总数 × 该类菌落证实阳性数 ÷ 该类菌落挑取数

如果平板上有典型菌落和可疑菌落两类，应分别计算后相加，再乘以相应稀释倍数，得到样品中的大肠菌群数。

例如，某 1:10 稀释度平板上有 10 个可疑大肠菌群菌落、6 个典型大肠菌群菌落。分别挑取可疑菌落 5 个、典型菌落 5 个做 BGLB 证实。若可疑菌落中 3 个证实阳性，典型菌落中 5 个证实阳性，则：

可疑菌落经证实数 = 10 × 3 ÷ 5 = 6
典型菌落经证实数 = 6 × 5 ÷ 5 = 6
平板经证实大肠菌群数 = 6 + 6 = 12

若该平板对应 1:10 稀释度，且接种量按标准计算后对应乘以 10，则结果约为 120 CFU/g 或 CFU/mL。原文示例中用“10×(6/10)×10 + 6×(5/6)×10 = 110”的写法存在逻辑不够清晰的问题：挑取数量、证实阳性数量和菌落总数应一一对应，实际计算应按标准规定的计数与修约规则执行。

十、VRBA 操作中的常见误区

第一，误把 VRBA 当作必须高压灭菌的培养基。VRBA 通常煮沸溶解后使用，过度高温会影响性能。

第二，培养基剩余后反复冷藏再熔化。VRBA 不宜反复加热，容易喷溅，也可能影响选择性和显色。

第三，只挑典型菌落，不挑可疑菌落。这样可能漏掉形态不典型的大肠菌群。

第四，不做 BGLB 证实就直接报告。VRBA 是选择性分离计数培养基，证实试验是提高结果准确性的重要环节。

第五，两个稀释度都在计数范围内时随意选择一个。应按标准规则处理，保证结果代表性。

第六，覆盖层温度过高或加入过早。温度过高可能损伤菌体，过早覆盖可能扰动底层样品和培养基，影响菌落形成。

十一、小结

大肠菌群平板计数法看似简单，实则对细节要求较高。VRBA 培养基应新鲜配制、充分溶解、避免过度加热和反复熔融；平板是否覆盖、菌落如何挑取、BGLB 证实如何判定、两个稀释度如何处理，都应严格按照现行标准和实验室 SOP 执行。

对于新手检验员，建议在初期对 VRBA 上不同形态菌落都进行证实试验，通过多次对照建立形态判断经验。最终结果应以经证实的大肠菌群数为依据，而不是单纯依赖平板颜色和菌落外观。规范操作、准确证实和正确计算，是保证大肠菌群平板计数结果可靠的关键。