创伤弧菌检验标准操作程序解析：定性检验、PCR鉴定与MPN计数

创伤弧菌，学名 Vibrio vulnificus，是一类嗜盐性革兰氏阴性弧菌，常存在于海水、近岸水体、贝类、鱼虾蟹等水产品中。它与食用生鲜或未充分加热的海产品、伤口接触海水或水产品有关，尤其对肝病、免疫功能低下和老年人等高风险人群危害较大。与一些常见食源性细菌相比，创伤弧菌感染虽然发生率不一定高，但病程进展快、风险高，因此水产品中的创伤弧菌检测具有重要食品安全意义。

本操作程序来源于 FDA BAM Chapter 9: Vibrio（2004 版）相关方法，适用于食品中创伤弧菌的定性检验和 MPN 计数。方法思路是：先用含 3%氯化钠的碱性蛋白胨水增菌，再在 mCPC 或 CC 选择性平板上分离可疑菌落，随后通过氧化酶、革兰染色、三糖铁、嗜盐性、生化反应或 PCR 方法进行确认，最终报告 25 g 或 25 mL 样品中检出或未检出创伤弧菌，或以 MPN/g（mL）报告数量。

一、方法特点与检测思路

创伤弧菌属于嗜盐性弧菌，对盐分有一定需求。普通非加盐培养基不一定适合其恢复和生长，因此本方法使用 3%氯化钠碱性蛋白胨水作为增菌液，并使用 mCPC 琼脂或 CC 琼脂进行选择性分离。mCPC 和 CC 培养基中含有纤维二糖以及多黏菌素类选择剂，可帮助筛选创伤弧菌可疑菌落。

与 GB 4789.44—2020 中的 PNCC 增菌流程相比，这版 SOP 更接近 FDA BAM 的经典定性和 MPN 计数思路：用 3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌，选择性平板分离，再结合生化或 PCR 确认。实际使用时应根据检测目的、标准要求和实验室受控文件确定最终方法。

二、主要设备与试剂

除常规微生物灭菌、接种和培养设备外，创伤弧菌检验还需要 36℃±1℃和 39.5℃±0.5℃恒温培养箱、7℃～10℃样品保存条件、均质器或无菌乳钵、PCR 仪、电泳装置、凝胶成像系统和高速离心机等。

培养基中 3%氯化钠的加入非常关键。创伤弧菌在适宜盐浓度下生长较好，若培养基盐浓度不合适，可能影响目标菌恢复、分离和生化反应判读。

三、样品保存与取样要求

非冷冻样品采集后应立即置 7℃～10℃ 条件下保存，并尽可能及早检验。该温度要求与创伤弧菌容易在低温下进入活而不可培养状态有关，因此不建议简单按普通水产品样品长期 4℃冷藏处理。

冷冻样品应在 45℃以下不超过15 min，或在 2℃～5℃不超过18 h 条件下解冻。解冻过慢、反复冻融或温度过高，均可能影响目标菌状态和检出率。

不同水产品的取样部位应根据样品类型确定：鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃；贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或中心部分，包括肠和鳃。带壳贝类或甲壳类应先用自来水洗刷外壳并甩干表面水分，再无菌打开外壳取样，避免外壳污染带入内部样品。

四、样品制备与增菌

无菌操作取样品 25 g 或 25 mL，加入 225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或用拍击式均质器拍击 1 min～2 min，制备成 1:10 样品匀液。

若无均质器，可将样品放入无菌乳钵中，先从 225 mL 增菌液中取少量加入乳钵，研磨样品后转入 500 mL 无菌锥形瓶，再用少量增菌液冲洗乳钵残留样品 1～2 次，洗液一并转入锥形瓶，最后加入剩余增菌液并充分振荡。

将 1:10 样品匀液置 36℃±1℃培养18 h～24 h。增菌的目的是促进创伤弧菌恢复和增殖，提高后续分离检出率。样品中若含有大量背景菌，增菌液和选择性平板的质量将直接影响结果。

五、选择性分离：mCPC 与 CC 平板

对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下约 1 cm 处沾取一环增菌液，划线接种于 mCPC 平板或 CC 平板。平板置 39℃～40℃过夜培养；若实验室条件达不到 39℃～40℃，可按 SOP 在 35℃～37℃ 条件下培养，但应注意方法一致性和结果可比性。

典型创伤弧菌在 mCPC 和 CC 平板上表现为：圆形、扁平、中心不透明而边缘透明的黄色菌落，直径约 1 mm～2 mm。这些菌落为可疑菌落，应进入纯培养和鉴定流程。

选择性平板上的黄色菌落不能直接报告阳性。部分其他弧菌或背景菌也可能形成相似菌落，因此必须结合生化或 PCR 方法确认。

六、纯培养与初步鉴定

挑取 3 个或以上可疑菌落，划线接种于 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，置 36℃±1℃培养18 h～24 h，获得纯培养物。

初步鉴定包括氧化酶试验、革兰染色镜检、3%氯化钠三糖铁琼脂试验和嗜盐性试验。

氧化酶试验应使用新鲜试剂并及时判读。嗜盐性试验是区分创伤弧菌与其他弧菌的重要依据之一，但不同菌株可能存在一定差异，应结合完整生化谱判断。

七、确证鉴定：生化反应组合判断

取纯培养物分别接种含 3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基和 MR-VP 培养基，36℃±1℃培养 24 h～48 h 后观察结果；另取 3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行 ONPG 试验。也可使用经验证的生化鉴定试剂盒。

创伤弧菌典型生化性状如下：

创伤弧菌与副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、河弧菌、弗氏弧菌、梅氏弧菌、霍利斯弧菌、嗜水气单胞菌和类志贺邻单胞菌等在部分反应上存在相似性。鉴定时应综合氧化酶、糖类利用、赖氨酸脱羧酶、ONPG、嗜盐性等多项结果，不宜只依赖单一生化反应。

八、PCR鉴定：可选的快速确认方法

PCR 鉴定为选做项目，可用于对纯培养可疑菌落进行快速确认。模板制备时，取可疑纯菌落加入 500 μL 灭菌水中混匀，煮沸 10 min，以 15000×g 离心3 min，取上清液作为 DNA 模板，-20℃保存备用。也可使用商品化 DNA 提取试剂盒制备模板。

常用引物为：

Vvh-785F：5'-CCGCGGTACAGGTTGGCGCA-3'

Vvh-1303R：5'-CGCCACCCACTTTCGGGCC-3'

扩增片段长度为 519 bp。

PCR 反应体系为 50 μL：灭菌水 28.2 μL，10×Buffer/MgCl₂ 5.0 μL，dNTPs 8.0 μL，引物 7.5 μL，模板 1.0 μL，Taq 酶 0.3 μL。反应程序为：94℃预变性 10 min；94℃ 1 min、62℃ 1 min、72℃ 1 min，25 个循环；72℃终延伸 10 min；8℃保存。

电泳可用 0.5×TBE 配制 1.5%琼脂糖凝胶，加入 EB 或 GoldView 等核酸染料。取 5 μL PCR 产物点样，以 100 bp～1000 bp DNA 分子量标记物作参照，100 V 电泳约 50 min，并用凝胶成像系统记录结果。

在阴性对照无条带、阳性对照出现预期条带的前提下，若待测样品出现 519 bp 条带，则可判定该纯菌株 PCR 鉴定阳性；若未出现该条带，则为阴性。若阴性对照出现条带或阳性对照未出现预期条带，本次 PCR 结果无效，应重做实验并排查污染或扩增失败。

九、定性结果报告

根据生化或 PCR 鉴定结果，报告 25 g 或 25 mL 样品中检出或未检出创伤弧菌。

定性报告应基于纯培养菌株的确证结果。若选择性平板有可疑菌落但后续鉴定不符合，不能报告检出。

十、第二法：MPN计数法

MPN 计数法适用于估计样品中创伤弧菌数量，尤其适合低水平污染或直接平板计数不易进行的样品。

1. 样品制备与系列稀释

样品制备同定性方法。用无菌吸管吸取 1:10 样品匀液1 mL，加入含 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管中，振摇混匀，制备 1:100 样品匀液。继续按 10 倍系列稀释，每递增稀释一次，更换一支新的 1 mL 无菌吸管。

2. 三管法增菌

根据污染水平估计，选择 3 个连续适宜稀释度。每个稀释度接种 3 支含 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种 1 mL。置 36℃±1℃培养18 h～24 h。

培养后，对显示生长的试管进行分离鉴定，操作同定性检测。只有经分离和生化或 PCR 确认为创伤弧菌的试管，才能计为阳性管。

3. MPN结果报告

根据每个稀释度中证实为创伤弧菌阳性的试管数，查 MPN 检索表，报告每 g 或每 mL 样品中创伤弧菌的 MPN 值。

MPN 法的关键是“阳性管”必须经过确认。单纯增菌液混浊不能代表创伤弧菌阳性，因为背景菌也可在增菌液中生长。

十一、常见问题与注意事项

第一，非冷冻样品应置 7℃～10℃保存并尽快检验，避免长期低温保存影响创伤弧菌培养检出。

第二，贝类应取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类应关注肠和鳃等部位，保证样品代表性。

第三，3%氯化钠碱性蛋白胨水是关键增菌液。盐浓度、pH 和培养时间都会影响目标菌恢复。

第四，mCPC 和 CC 平板上的黄色菌落只是可疑菌落，不能直接报告阳性。

第五，分离平板培养温度推荐 39℃～40℃。若实验室使用 35℃～37℃，应保持方法一致并关注菌落典型性差异。

第六，生化鉴定应使用纯培养物。同一可疑菌落来源应尽量保持一致，避免混合菌导致结果矛盾。

第七，嗜盐性试验要同时观察多个盐浓度，仅看单一盐浓度不能可靠判断。

第八，PCR 鉴定必须设置阳性和阴性对照。对照异常时，样品结果无效。

第九，MPN 法中增菌液混浊不等于阳性，必须经分离和确证后才能计为阳性管。

十二、小结

创伤弧菌检验是一项以嗜盐性增菌、选择性分离和确证鉴定为核心的食品微生物检测方法。该 SOP 采用 3%氯化钠碱性蛋白胨水制备 1:10 样品匀液并增菌，经 mCPC 或 CC 平板分离黄色可疑菌落，再通过 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂纯培养、氧化酶、革兰染色、三糖铁、嗜盐性、生化反应或 PCR 方法确认。

定性检验用于报告 25 g 或 25 mL 样品中检出或未检出创伤弧菌；MPN 计数法则通过多管增菌、分离确认和 MPN 表计算样品中创伤弧菌数量。该方法的关键控制点包括样品保存温度、增菌液质量、选择性平板典型性、纯培养鉴定和 PCR 质控。规范执行这些步骤，是保证创伤弧菌检测结果准确可靠的基础。