化妆品中菌落总数检验方法解析

菌落总数是化妆品微生物质量控制中最基础、最常用的检测项目之一。它反映的是化妆品检样经过处理后，在规定培养基、培养温度、培养时间、pH 和需氧条件下，能够形成可见菌落的嗜中温需氧菌和兼性厌氧菌总数。通过菌落总数检测，可以初步判断产品受细菌污染的程度，是评价化妆品一般卫生状况、防腐体系有效性和生产过程控制水平的重要指标。

需要注意的是，菌落总数并不等同于样品中全部微生物的真实总数。只有能在本方法规定条件下生长并形成菌落的微生物，才会被计入结果。因此，该方法本质上是“可培养细菌计数”，结果通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。

一、方法适用范围与检测意义

本方法适用于化妆品中菌落总数的测定。化妆品基质复杂，既有水剂、乳液、膏霜、凝胶，也有粉类、油性产品和含表面活性剂产品。不同基质中微生物的存活状态和分散难度不同，因此检测前的样品处理、稀释和中和非常关键。

测定菌落总数的意义在于判断产品被细菌污染的程度。若菌落总数偏高，可能提示原料、水源、生产环境、人员操作、包装材料、设备清洗或防腐体系存在问题。但菌落总数结果本身不能直接说明是否存在特定致病菌，还需要结合耐热大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等项目综合评价。

二、培养基原理：为什么使用卵磷脂、吐温80-营养琼脂？

化妆品中常含有防腐剂、表面活性剂、香精、油脂和其他抑菌成分。如果直接接种普通营养琼脂，样品中残留的抑菌物质可能继续抑制微生物生长，导致菌落总数偏低。因此，方法中使用 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基，其核心作用是支持细菌生长，同时中和部分抑菌成分。

制备时，先将卵磷脂加入少量蒸馏水中加热溶解，再加入吐温80；其他成分除琼脂外溶解于其余蒸馏水中，然后合并混匀，调 pH 至 7.1～7.4，加入琼脂后 121℃高压灭菌20 min，储存于冷暗处备用。

卵磷脂和吐温80的加入，是化妆品菌落总数检验区别于普通食品菌落总数检测的重要特点之一。它们有助于减弱样品防腐体系对检测结果的干扰，提高受抑制细菌的检出机会。

三、TTC 的作用：帮助区分菌落和化妆品颗粒

部分化妆品含有色素、珠光剂、粉体、植物颗粒或不溶性杂质，在平板上可能与小菌落混淆。为便于区分颗粒与细菌菌落，可在每 100 mL 卵磷脂吐温80营养琼脂中加入 1 mL 0.5% TTC 溶液。

TTC 全称为 2,3,5-三苯基氯化四氮唑，英文为 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride。它本身近无色或浅色，可被活细菌的脱氢酶系统还原生成红色甲臜类物质。因此，若有细菌生长，菌落可呈红色，而化妆品颗粒通常颜色不变。

TTC 溶液可过滤除菌，也可按方法要求 115℃高压灭菌20 min，装入棕色试剂瓶，置 4℃冰箱备用。由于 TTC 对部分微生物可能具有一定抑制性，是否添加应根据样品特点、方法要求和实验室验证结果决定，不宜随意提高浓度。

四、仪器设备与操作准备

菌落总数检测常用仪器包括 250 mL 三角瓶、200 mL 量筒、pH 计或精密 pH 试纸、高压灭菌器、18 mm×150 mm 试管、直径 90 mm 灭菌平皿、10 mL 和 1 mL 灭菌刻度吸管、酒精灯、36℃±1℃恒温培养箱、放大镜和恒温水浴箱。

操作前应确认培养基已完全融化并冷却至 45℃～50℃。温度过高可能损伤样品中的微生物，温度过低则容易提前凝固，导致检液与培养基混合不均。平皿、吸管、稀释液和操作环境应符合无菌要求，避免空白对照污染。

五、样品稀释与接种步骤

用灭菌吸管吸取 1:10 稀释检液 2 mL，分别加入两个灭菌平皿，每皿 1 mL。另取 1 mL 1:10 检液加入 9 mL 灭菌生理盐水试管中，注意吸管不要接触液面，充分混匀，制成 1:100 检液。随后更换一支灭菌吸管，吸取 1:100 检液 2 mL，分别加入两个灭菌平皿，每皿 1 mL。

若预计样品含菌量较高，可继续制备 1:1000、1:10000 等更高稀释度。每个稀释度均应更换新的灭菌吸管，防止高浓度检液带入低浓度稀释管，造成结果偏高。

随后将融化并冷却至 45℃～50℃ 的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注至平皿内，每皿约 15 mL。立即轻轻转动平皿，使检液与培养基充分混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿，置 36℃±1℃培养48h±2h。

同时，应设置空白对照：另取一个不加检液的灭菌空平皿，加入约 15 mL 同批培养基，凝固后同条件培养。空白对照用于判断培养基、平皿和操作过程是否受到污染。若空白对照有菌落生长，应评估本次检测结果有效性，必要时重新检测。

六、菌落计数方法

培养结束后，先用肉眼观察并点数菌落，再用 5倍～10倍放大镜检查，以防遗漏小菌落。记录各平皿菌落数后，计算同一稀释度两个平皿的平均菌落数。

若平皿中出现连成片状的菌落或花点样蔓延菌落，该平皿通常不宜计数。若片状菌落不到平皿面积的一半，而其余一半菌落分布均匀，可将未受影响半个平皿的菌落数乘以 2，估算全皿菌落数。但这种情况应在原始记录中注明。

计数时应注意区分真正菌落与样品颗粒、气泡、沉淀、色素团块或培养基杂质。若样品颗粒较多，可考虑使用 TTC 辅助区分，但需注意 TTC 可能影响部分菌生长，使用前应确认适用性。

七、结果计算与报告规则

菌落总数测定通常选择平均菌落数在 30～300 CFU 范围内的平皿作为计数范围。

若只有一个稀释度的平均菌落数在 30～300 之间，则以该平均菌落数乘以对应稀释倍数报告。

若有两个连续稀释度的平均菌落数均在 30～300 之间，应分别计算两个稀释度对应的菌落总数，并求其比值。若比值小于或等于 2，报告两者平均数；若比值大于 2，则报告较低稀释度对应的菌落总数。

若所有稀释度平均菌落数均大于 300，则按最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。若所有稀释度平均菌落数均小于 30，则按最低稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。若相邻稀释度中一个大于 300、另一个小于 30，则选择更接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

若所有稀释度均无菌生长，报告为每 g 或每 mL 小于 10 CFU。若报告“不可计”，应注明样品稀释度和不可计原因。

菌落数在 10 以内时，可按实际数值报告；大于 100 时，通常采用两位有效数字，后续数字按四舍五入处理。为缩短数字后面的零，可用 10 的指数形式表示。例如 1200 CFU/g 可报告为 1.2×10³ CFU/g。

按重量取样的样品以 CFU/g 为单位报告；按体积取样的样品以 CFU/mL 为单位报告。

八、常见问题与注意事项

第一，样品必须充分混匀。化妆品常含油脂、粉体或增稠剂，微生物分布可能不均，混匀不足会导致平行平板差异大。

第二，培养基温度要控制在 45℃～50℃。过热会损伤细菌，过冷会提前凝固，影响菌落分布。

第三，空白对照不可省略。空白对照有菌落，提示培养基、平皿或操作过程可能污染，不能简单从样品结果中扣除。

第四，稀释时每个稀释度应更换吸管。否则容易造成交叉污染和计数偏差。

第五，TTC 不是必须添加项。它可帮助区分颗粒和菌落，但对部分菌有抑制风险，应根据样品干扰情况和验证结果使用。

第六，蔓延菌落会影响计数准确性。平板出现大片蔓延时，应按规定判断是否可计，并在记录中说明。

第七，化妆品防腐剂可能造成假低结果。对于抑菌性强的样品，应确认样品处理和培养基中和体系是否有效。

第八，培养时间和温度应严格控制。培养不足可能漏计慢生菌，培养过久可能导致菌落融合或蔓延。

九、培养基质量对结果的影响

菌落总数检测高度依赖培养基性能。卵磷脂吐温80营养琼脂应外观均一、无污染、pH 符合要求，琼脂凝固状态良好。培养基中卵磷脂和吐温80的分散状态也很关键，若乳化不充分，可能影响中和效果和培养基均一性。

对于培养基生产和使用实验室，应定期进行培养基适用性检查，包括无菌性、促生长能力、pH、外观和批间稳定性。若使用 TTC，应确认 TTC 溶液浓度、保存条件和加入量准确，避免因染料失效或浓度过高影响结果。

十、小结

化妆品菌落总数检验用于评价产品受细菌污染程度和一般卫生状况。该方法通过样品稀释、倾注卵磷脂吐温80营养琼脂、36℃±1℃培养48h±2h，并选择 30～300 CFU 范围内的平板计数，最终以 CFU/g 或 CFU/mL 报告结果。

该方法的关键在于：样品充分分散，培养基具备良好中和和促生长能力，倾注温度适宜，空白对照合格，计数范围选择正确，报告规则规范。对于含防腐剂、表面活性剂、油脂或颗粒较多的化妆品，应特别关注中和效果和菌落识别，必要时可使用 TTC 辅助区分颗粒和菌落。

菌落总数检测虽是基础项目，但它直接反映原料、水源、生产环境、人员操作、包装和防腐体系的综合控制水平。规范执行该方法，是化妆品微生物质量控制的重要基础。