药典微生物检验中的菌种管理：来源、代次、保存与工作菌液控制

在药典微生物检验中，菌种是培养基适用性检查、方法适用性试验、阳性对照、抑菌效力检查和环境监测方法确认的基础材料。菌种管理不规范，可能导致试验菌活力下降、表型改变、污染混杂、接种量失准，进而影响培养基质控和检验结果判断。因此，菌种管理应纳入微生物实验室质量体系，而不是仅凭经验传代和使用。

药典微生物实验室管理的基本原则是：试验菌应来源明确、可追溯；标准储备菌株、工作菌株和工作菌液应分级管理；菌株传代次数应受控；每次制备和使用应有完整记录；冻存、复苏、传代、菌悬液制备和废弃处理均应按 SOP 执行。

一、菌种来源：标准菌株优先，等效菌株需可追溯

药典检验中使用的试验菌，应优先采用药典规定的菌株编号或认可菌种保藏机构提供的标准菌株。例如药典方法中列明 CMCC、ATCC、CMCC(B)、CMCC(F) 等编号时，实验室应按标准要求选择相应菌株。若使用商业派生菌株或等效菌株，应能证明其来源清楚、代次明确，并与标准菌株相关特性等效。

需要注意的是，不能简单认为“CMCC 可以随意用 ATCC 替代”或“名称相同就一定等效”。不同保藏机构的菌株可能存在历史传代、编号对应关系和表型差异。若法定标准明确规定菌株编号，原则上应按规定执行；如需替代，应有充分技术依据、质量体系批准和法规适用性评估。

从保藏机构购入的冻干菌种或标准菌株，进入实验室后应建立菌种档案，包括菌株名称、编号、来源、批号、到货日期、复苏日期、代次、保存方式、使用范围、纯度确认和特性确认结果等。供应商证书、说明书和复苏记录也应一并归档。

二、标准储备菌株、工作菌株和工作菌液要分级管理

菌种管理通常分为三个层级：标准储备菌株、工作菌株和工作菌液。标准储备菌株是由外部标准菌株复苏后，在适宜培养基中培养并经纯度和特性确认后制备的长期保存菌株。工作菌株由标准储备菌株制备，用于一定周期内的日常试验。工作菌液则是为某次试验制备的菌悬液，通常用于加菌、阳性对照或回收率试验。

分级管理的目的，是减少标准菌株反复传代带来的遗传漂移和表型变化。标准储备菌株不应频繁开启和反复使用；工作菌株应有明确使用期限和传代次数；工作菌液应尽量现用现配，并在规定时间内使用。

现行指导原则提出，标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株；冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。 这意味着实验室应避免“一管冻存菌反复解冻、反复取用”的做法，因为反复冻融会降低活力并增加污染和变异风险。

三、代次控制：冻干原始菌种可作为第 0 代

菌株代次控制是药典微生物检验中非常重要的管理内容。通常情况下，由认可菌种保藏机构提供的冻干菌种可作为第 0 代；复苏后培养形成的标准储备菌株、工作菌株和工作菌液，应按实验室 SOP 明确代次计算规则。

工作用菌液一般应视为一次传代或亚培养的一部分，因为它来自已培养菌株并用于后续试验。实验室应在记录中明确每一次复苏、转种、传代和制备菌悬液对应的代次，避免因记录不清导致超代使用。

不同实验室可能对代次命名略有差异，但必须做到内部一致、可追溯、可审核。建议在菌株标签上标注菌名、编号、代次、制备日期、有效期、制备人和保存条件，防止错用、混用或超期使用。

四、纯度和特性确认：新进菌株必须确认

从外部购入的菌株进入实验室菌种保藏体系时，应进行纯度和特性确认。纯度确认主要是证明该菌株无杂菌污染；特性确认则是证明其形态、生长特征和关键反应符合预期。

基层微生物实验室可从以下几个方面进行确认：观察菌落形态，如颜色、大小、边缘、透明度、表面状态、溶血或色素；进行显微镜检查和染色，如革兰氏染色、芽孢染色或真菌形态观察；进行关键生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶、糖发酵或其他特征试验；必要时使用 API、自动化生化鉴定系统、MALDI-TOF 质谱或分子鉴定方法确认。

并不是每次工作传代都必须做完整鉴定。日常传代可根据菌株风险和用途进行简化确认，例如观察菌落形态、显色培养基典型反应、镜检或关键生化反应。但若出现菌落异常、促生长能力异常、对照结果异常、保存时间过长、超代风险或污染怀疑，应重新进行纯度和特性确认。

五、菌种保存：优先选择低温冻存或冻干保存

菌种保存方式应根据菌种类型、使用频率和实验室条件确定。常见保存方法包括斜面短期保存、甘油低温冻存、液氮保存和冻干保存。对于药典试验菌，推荐采用能稳定保持菌株特性的保存方式。

低温冷冻保存适用于多数细菌和部分真菌。实验室若采用超低温保存，应配置能稳定达到 -70℃或更低温度的超低温冰箱，并建立温度监测、报警、备用电源或应急转移方案。指导原则也指出，低于 -70℃或低温冷冻干燥方法可以延长菌种保存时间。

铜绿假单胞菌等常用试验菌可采用低温甘油冻存方式保存。黑曲霉等真菌冻干菌种复苏后，应选择适合其生长和产孢的培养基进行培养，例如沙氏葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂或药典方法规定的适宜培养基；原文提到“改良马丁琼脂”，在部分药典体系和历史方法中可用，但实际应以现行药典、菌种供应商说明书和实验室验证结果为准。

六、浓菌液与稀释菌液：有效期不能混淆

菌液管理需要区分浓菌液和稀释菌液。浓菌液通常指较高浓度的菌悬液，可能用于短期内多次稀释制备工作菌液；稀释菌液通常指已调整到目标接种量范围、准备直接用于试验的菌液。

药典方法中常对稀释菌液的使用时间提出要求，例如制备后尽快使用，或在特定低温条件下限定时间内使用。其目的在于减少菌数变化和活力下降对加菌量的影响。浓菌液若需要保存，则不能直接套用稀释菌液规定，应通过实验确定有效期。

浓菌液有效期可通过不同时间点测定活菌数、观察纯度、评价典型形态和试验表现来确定。例如在制备当天、24 h、48 h、72 h 或更长时间点进行平板计数，比较菌数变化，并结合预期用途确定可接受范围。若菌液用于药典方法适用性试验或阳性对照，应采用更严格的有效期管理。

七、工作菌液接种量：无法“提前精确知道”，但可以受控

很多实验室会遇到一个问题：菌液制备后要在规定时间内使用，但平板计数结果需要培养后才能知道，那么如何保证加入的菌量准确？这里需要理解，微生物试验无法像化学标准溶液那样在使用前立即精确知道“活菌数”。实际控制依赖的是标准化的制备流程和历史验证数据。

可采用的方法包括：建立稳定的菌种复苏和培养条件；规定菌龄、培养基、培养温度和培养时间；采用浊度法、比浊管、分光光度法或商品化标准菌悬液进行初步调整；通过预实验建立浊度与 CFU 的对应关系；每次试验同步做菌液计数，作为结果有效性判断依据。

因此，工作菌液不需要等平板计数结果出来后再做适用性检查或阳性对照。正确做法是在同一次实验中完成菌液稀释、加菌和同步计数，并根据计数结果判断本次加菌量是否符合要求。如果同步计数显示超出规定范围，本次试验结果应按 SOP 评估是否有效。

八、是否可以同时操作多种工作菌株？

方法适用性试验和培养基适用性检查常需要同时使用多种试验菌。多菌株可以在同一天操作，但应严格防止交叉污染。关键措施包括分区操作、一次只打开一种菌株、使用独立吸头和接种环、清晰标签、操作前后消毒、避免在同一超净台或生物安全柜内同时暴露多种开放菌液，以及按从低风险到高风险、从阴性到阳性的顺序安排操作。

如果使用生物安全柜操作，应避免过多物品堆放影响气流。每种菌株操作完成后，应及时封闭容器、清洁台面、处理废弃物，再进入下一种菌株操作。对于容易产孢或形成气溶胶的菌株，如枯草芽孢杆菌、黑曲霉等，更应加强操作控制，避免污染环境或影响其他菌株试验结果。

九、CMCC、ATCC 与 COA：关注法规适用性和可追溯性

ATCC、CMCC 等菌株编号代表不同保藏机构或体系中的标准菌株。企业在药典检验中应优先使用标准列明的菌株编号。若使用不同来源的等效菌株，应关注是否有明确的溯源证明、等效性依据和监管接受性。

部分国内保藏机构提供的菌株可能无法提供与 ATCC 完全相同格式的 COA，但应至少具备菌株名称、编号、来源、批号或内部编号、复苏说明、保存条件等可追溯信息。实验室应结合供应商资质和自身确认结果建立完整档案。

对于关键菌株，如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉等，应特别重视来源和代次管理，因为这些菌株直接用于培养基质控和方法适用性判断。

十、菌种管理记录应包括哪些内容？

完整的菌种管理记录应覆盖菌种全生命周期。建议至少包括以下内容：菌株名称、编号、来源、到货日期、批号或证书编号、复苏日期、复苏培养基、培养条件、纯度确认、特性确认、保存方式、冻存管编号、代次、使用记录、废弃记录、异常情况和偏差处理。

对于工作菌液，还应记录制备日期、制备人、来源菌株代次、培养条件、稀释方法、目标菌量、实际计数结果、使用项目、使用时间和剩余菌液处理方式。若菌液用于方法适用性试验、培养基适用性检查或阳性对照，应能从检验记录追溯到具体菌株和代次。

菌种记录的价值不只是应对检查，更是当培养基适用性不合格、阳性对照异常、回收率偏低或污染调查发生时，帮助实验室快速定位问题来源。

结语

药典微生物检验中的菌种管理，是保证实验结果一致性和可追溯性的基础。标准菌株来源是否清楚、代次是否受控、纯度和特性是否确认、保存条件是否稳定、工作菌液浓度是否可靠，都会影响培养基适用性检查、方法验证和阳性对照结果。

实验室应建立“标准储备菌株—工作菌株—工作菌液”的分级管理体系，避免反复传代、反复冻融和超期使用。对于每一次菌种复苏、传代、冻存和使用，都应做到有记录、有确认、有追溯。只有菌种体系稳定，微生物检验数据才具有真正的可靠性和可解释性。