公共场所拖鞋微生物检验方法：霉菌和酵母菌总数测定要点

公共场所拖鞋常见于宾馆、浴室、足浴场所、游泳场所及其他公共服务场景。由于拖鞋直接接触足部皮肤，且使用环境往往潮湿、温暖，若清洗、消毒、干燥和周转管理不到位，表面容易残留或滋生真菌。霉菌和酵母菌总数检验可用于评价拖鞋表面真菌污染水平，是公共用品用具卫生状况监测的重要内容之一。

需要注意的是，原资料中“化妆品检样”“1 g或1 mL化妆品中”等表述并不适用于拖鞋检验。公共场所拖鞋属于公共用品用具，检测对象是拖鞋与足部接触表面的微生物污染，结果应按涂抹面积进行报告，而不是按食品或化妆品的质量、体积单位报告。

一、检测原理：为什么检测霉菌和酵母菌？

霉菌和酵母菌是真菌类微生物，在潮湿环境中较易生长。公共场所拖鞋若清洗消毒不彻底、未充分晾干或重复交叉使用，可能造成真菌污染水平升高。霉菌和酵母菌总数检测并不是直接诊断某一种致病真菌，而是通过培养计数反映拖鞋表面真菌污染程度和一般卫生状况。

传统方法常使用虎红培养基进行培养。虎红培养基可抑制部分细菌蔓延，并有利于霉菌和酵母菌形成可计数菌落。现行公共场所公共用品用具微生物指标标准中，真菌总数检测更强调按规定培养基、温度、时间和结果报告规则执行，实际检测应以现行有效标准为准。

二、采样部位：选择鞋面与脚趾接触处

拖鞋采样应选择与足部直接接触、最容易污染的位置。原方法规定，用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水，在每只拖鞋鞋面与脚趾接触处5 cm×5 cm面积上，有顺序地均匀涂抹3次。一双拖鞋作为一份样品，因此总涂抹面积为50 cm²。

采样时应按同一方向、同一力度涂抹，尽量覆盖整个规定面积。涂抹过轻会导致回收率偏低，涂抹不均会影响结果代表性。采样后用灭菌剪刀剪断棉拭子手持部分，将棉拭子头放入装有10 mL无菌生理盐水和玻璃珠的无菌试管中。

三、样品洗脱：让真菌孢子充分分散

采样后的棉拭子需要在生理盐水中充分洗脱，使附着在棉拭子上的霉菌孢子和酵母细胞进入液体中。原方法要求将盛有棉拭子的盐水管在手心用力振荡100次，再用带橡皮乳头的1 mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。该液体作为1:10样品匀液。

霉菌孢子容易成团，若分散不充分，平板上可能形成局部集中菌落，导致计数偏低或重复性差。因此，样品洗脱和分散是拖鞋真菌总数检测中的关键步骤。

四、十倍递增稀释：每次稀释都要更换吸管

取1:10样品匀液2 mL，分别加入2个无菌平皿中，每皿1 mL。另取1 mL 1:10样品匀液加入装有9 mL无菌生理盐水和玻璃珠的试管中，换用新的1 mL无菌吸管反复吹吸或振荡混匀，制成1:100样品匀液。随后按同样方式继续进行10倍递增稀释。

每递增稀释一次，都应更换一支无菌吸管或吸头，避免高浓度样液带入低浓度稀释液，造成稀释误差。稀释前后都应充分混匀，尤其是含霉菌孢子的样品，不能只轻轻摇动。

五、接种与培养：倾注平板后倒置培养

根据样品污染情况，选择3个适宜稀释度进行接种。每个稀释度通常做平行平板。将样品液加入无菌平皿后，倒入已融化并冷却至约45 ℃的培养基，轻轻旋转平皿使样液与培养基混匀。待琼脂凝固后，倒置于25 ℃～28 ℃培养箱中培养。

原方法中提到3天后开始观察，并连续观察至1周。这样做的原因是酵母菌通常生长较快，而部分霉菌生长较慢，延长观察有助于发现迟缓生长菌落。但培养时间过长也可能出现菌落蔓延、重叠或水分散失，因此应按标准方法规定时间判读，并做好连续记录。

如果培养基温度过高，可能损伤酵母细胞或霉菌孢子；如果温度过低，培养基易提前凝固，导致样液分布不均。倾注平板时应动作轻柔，避免产生气泡影响菌落计数。

六、菌落计数：通常选择30～100个菌落的平板

真菌总数计数时，通常选择菌落数在30～100之间的平板进行计数。同一稀释度两个平板的菌落数取平均值，再乘以稀释倍数，得到样品中的真菌菌落数。若有两个稀释度的菌落数均在规定范围内，或所有稀释度均不在范围内，应按相应计数规则报告。

对于霉菌平板，若菌丝蔓延明显，容易覆盖其他菌落，使计数偏低或无法准确计数。因此，培养过程中应及时观察并记录，避免过晚判读导致菌落融合。

七、结果报告：按涂抹面积表达

原资料中给出的报告公式为：

m = n × k

其中，m为真菌菌落数，单位为cfu/50 cm²；n为每皿平均真菌菌落数；k为稀释倍数。由于一双拖鞋的涂抹面积为50 cm²，因此该结果表示一双拖鞋规定采样面积上的真菌污染水平。

结果报告时应注明采样面积、样品数量、稀释度、培养基、培养温度、培养时间和计数规则。若采用现行标准，应按现行标准规定的单位和报告格式执行。

八、常见问题与控制建议

九、与培养基质量控制的关系

拖鞋真菌总数检测对培养基质量要求较高。培养基应能支持霉菌和酵母菌生长，同时尽量抑制细菌干扰。传统虎红培养基可用于霉菌和酵母菌计数，但不同标准或检测体系可能采用不同培养基，如沙氏琼脂等。因此，实验室应按所执行标准选择培养基，并做好无菌性、促生长能力和抑制能力验证。

培养基倾注温度、pH、抗菌成分、琼脂凝胶强度和储存状态都会影响真菌菌落形成。若培养基过热倾注，可能造成真菌损伤；若培养基保存不当，可能水分蒸发、抑制剂失效或出现污染。对于培养基生产和使用实验室，应重点关注批间一致性和质控菌株表现。

小结

公共场所拖鞋霉菌和酵母菌总数检测，是评价拖鞋表面真菌污染状况的重要方法。其关键步骤包括：在每只拖鞋与脚趾接触处5 cm×5 cm面积上涂抹采样，将棉拭子置于10 mL无菌生理盐水中充分洗脱，制备10倍递增稀释液，选择适宜稀释度倾注平板，在25 ℃～28 ℃条件下培养并计数。

这类检测的核心控制点是采样面积准确、涂抹均匀、孢子充分分散、稀释操作规范、培养基质量稳定和计数规则清晰。发布或执行检测方法时，应注意区分旧版方法资料与现行公共场所卫生检验标准，实际出具检测结果应以当前有效标准为准。